李志鵬 劉晗璐 崔學(xué)哲 荊 祎 鮑 坤 徐 超 楊福合 李光玉

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130112)

梅花鹿(Cervus nippon)屬于鹿科鹿屬的中型反芻動(dòng)物，其產(chǎn)品(如鹿茸)具有較高的藥用價(jià)值。與其他反芻動(dòng)物一樣，梅花鹿依賴瘤胃微生物將結(jié)構(gòu)性碳水化合物降解為揮發(fā)性脂肪酸為機(jī)體提供能量。在自然條件下，梅花鹿采食范圍廣，而且對(duì)一些含有毒素的植物(如狼毒花、飛燕草和富含單寧枝葉等)具有耐受性［1］，這表明梅花鹿瘤胃微生物可能具有一定獨(dú)特性。楊鎰峰等［2］研究表明，飼糧中添加2%單寧可提高梅花鹿蛋白質(zhì)代謝率。Hiura等［3］發(fā)現(xiàn)北海道地區(qū)野生梅花鹿也喜采食單寧含量高的樹葉，并從瘤胃中分離到可有效降解單寧的鏈球菌屬(Streptococcus spp.)。Pope等［4］和 Sundset等［5－6］對(duì)挪威地區(qū)馴鹿瘤胃微生物區(qū)系研究表明，馴鹿瘤胃內(nèi)細(xì)菌主要由擬桿菌門和厚壁菌門細(xì)菌組成，細(xì)菌區(qū)系與其他反芻動(dòng)物不同。而且Shi等［7］證明動(dòng)物種類對(duì)瘤胃微生物有顯著影響。牦牛、大額牛、晉南牛和羊駝的瘤胃細(xì)菌多樣性的研究已有報(bào)道［8－11］，但基于非培養(yǎng)技術(shù)分析梅花鹿瘤胃細(xì)菌區(qū)系的研究卻較少。本研究對(duì)以柞樹葉為主要粗飼料的梅花鹿瘤胃細(xì)菌16SrRNA基因序列進(jìn)行分析，研究梅花鹿瘤胃細(xì)菌區(qū)系，為豐富瘤胃微生物資源和揭示梅花鹿耐受單寧機(jī)制提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選用2頭2歲齡的裝有永久性瘤胃瘺管的成年雄性梅花鹿，平均體重130 kg，飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所茸鹿實(shí)驗(yàn)基地(北緯44.04°，東經(jīng)129.09°)。每天09:00和16:00定時(shí)定量各飼喂1次，以放牧狀態(tài)下梅花鹿喜歡采食的柞樹葉為主要粗飼料(柞樹葉單寧含量為0.973%)，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。持續(xù)飼喂30 d(2011年10月1日至2011年10月31日)。第31天09:00飼喂之前通過瘤胃瘺管取瘤胃內(nèi)容物，置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于－80°C冰箱備用。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the diet(air-dry basis) %

1.2 主要試劑

PCR相關(guān)試劑和酶購于TaKaRa公司;PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成;瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒(QIAEXⅡGel Extraction Kit)購于QIAGEN公司;克隆轉(zhuǎn)化試劑盒(TOPO TA Cloning Kit)購于Invitrogen公司。

1.3 基因組DNA提取

細(xì)菌基因組DNA提取按照Lamontagne等［12］和鄭剛等［13］方法進(jìn)行，略作修改。取0.5 g瘤胃固液混合物，加入800μL溶菌酶溶液［0.15 mol/L氯化鈉，0.2 mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)，10 mg/mL 溶菌酶，pH 8.0］和20 μL 蛋白酶K(20 mg/mL)。37℃、220 r/min震蕩1 h后，加入300μL裂解液［10%十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.1 mol/L 氯化鈉，0.5 mol/L 三羥甲基氨基甲烷 －鹽酸(Tris-HCl)緩沖液，pH 8.0］、300μL磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)和600μL 苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液，65 ℃水浴 30 min，每隔10 min在渦旋振蕩儀上振蕩30 s。4℃、5 000 r/min離心6 min，上清中加入0.6倍體積異丙醇，－80℃沉淀15 min。70%乙醇洗滌沉淀2～3次。適量TE緩沖液(pH 8.0)溶解粗提DNA，試劑盒純化粗提基因組DNA。

1.4 16S r RNA基因擴(kuò)增與克隆文庫構(gòu)建

細(xì)菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')擴(kuò)增細(xì)菌 16S rRNA 基因［14］。反應(yīng)體系50μL，反應(yīng)條件如下:95℃ 5 min;95℃30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 2 min(30個(gè)循環(huán));72℃10 min。利用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。將來自2頭動(dòng)物的等體積(10μL)PCR產(chǎn)物混合，按照試劑盒(TOPO TA Cloning Kit)說明書構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫。隨機(jī)挑選陽性克隆，用引物M13-47(5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3')和 RV-M(5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')對(duì)陽性克隆進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)PCR片段連接到載體。用上游引物27F對(duì)陽性克隆進(jìn)行單向測(cè)序，測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.5 16S r RNA基因序列分析

Bellerophon軟件去除可能嵌合體序列［15］。使用Ribosomal Database Project(RDP)Release 10(RDP10)中 Classifer程序?qū)λ行蛄蟹诸悾?6］。MOTHUR 軟件劃分分類操作單元(OTU)［17］，將相似性大于97%的序列視為同一個(gè)OTU［18］。選取每個(gè)OTU代表序列，利用BLAST程序在NCBI中搜索相似性最高序列［19］。以嗜火產(chǎn)液菌(Aquifex pyrophilus)為外群，利用 MEGA 5.05軟件中ClustalW比對(duì)后輸出為同一長度序列，利用Kimura-two參數(shù)矩陣模型和鄰接法(neighbor-joining，NJ)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，設(shè)置 Bootstrap值為1 000［20］。

2 結(jié)果

2.1 16S r RNA基因克隆文庫分析

本試驗(yàn)共獲得128個(gè)16S rRNA基因序列，其中21個(gè)為可能嵌合體序列。RDP分類表明107個(gè)克隆序列代表擬桿菌門和厚壁菌門細(xì)菌，所占比例分別為87.9%和12.1%。以97%序列相似性為閾值，107個(gè)序列分為22個(gè) OTUs(表2)。MOTHUR計(jì)算表明克隆文庫庫容值為84.3%，滿足分析要求。

表2 梅花鹿瘤胃細(xì)菌16S r RNA基因序列分析Table 2 Sequence analysis of bacteria 16S rRNA gene from the rumen of sika deer

107個(gè)序列中91個(gè)序列(10個(gè)OTUs)與已培養(yǎng)細(xì)菌的16S rRNA序列相似性≥97%，占總序列的85%。這些已培養(yǎng)菌包括:棲瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)(6 個(gè) OTUs，81.4%總克隆序列)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)(1個(gè) OTU，0.9% 總克隆序列)、Dialister succinatiphilus(1 個(gè) OTU，0.9%總克隆序列)、Sharpea azabuensis(1個(gè) OTU，0.9%總克隆序列)和規(guī)則糞球菌(Coprococcus eutactus)(1個(gè) OTU，0.9%總克隆序列)。13個(gè)序列(10個(gè)OTUs，12.2%總克隆序列)與已培養(yǎng)菌16S rRNA序列相似性處于90%～97%，包括:棲瘤胃普雷沃氏菌(2個(gè)OTUs，3.7%總克隆序列)、溶纖維丁酸弧菌(2個(gè)OTUs，1.8%總克隆序列)、棲牙普雷沃氏菌(Prevotella denticola)(2 個(gè) OTUs，2.8% 總克隆序列)、Dialister succinatiphilus(1 個(gè) OTU，0.9%總克隆序列)、Solobacterium moorei(1 個(gè) OTU，0.9% 總克隆序列)、Syntrophococcus sucromutans(1個(gè) OTU，0.9%總克隆序列)和糞便羅斯拜瑞氏菌(Roseburia faecis)(1個(gè) OTU，0.9%總克隆序列)。其余3個(gè)序列(2個(gè)OTUs，2.8%總克隆序列)與解溶紙梭菌(Clostridium papyrosolvens)相似性＜90%。

2.2 16S r RNA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

22個(gè)OTUs代表序列與24條相似序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明所有序列歸類于擬桿菌門和厚壁菌門2大簇(圖1)。所有與普雷沃氏菌屬(Prevotella spp.)相似序列均聚在擬桿菌門簇，3個(gè)相似性低的序列(SDX18、SDX64和SDX68)雖與已培養(yǎng)普雷沃氏菌屬聚在一起，但系統(tǒng)發(fā)育距離較遠(yuǎn)，因此可能代表新的普雷沃氏菌屬。厚壁菌門簇中，發(fā)育關(guān)系更為復(fù)雜，個(gè)別序列并未與其相似序列聚為一類。如糞便羅斯拜瑞氏菌相似序列SDX97(96%)與 Syntrophococcus sucromutans在發(fā)育關(guān)系上更近;溶纖維丁酸弧菌相似序列(SDX56和SDX65)并未與溶纖維丁酸弧菌聚在一起;Dialister succinatiphilus相似序列 SDX12(92%)與Solobacterium moorei聚為一類;SDX103和SDX107與解溶紙梭菌聚為一類，但發(fā)育距離較遠(yuǎn)，而且SDX103與?；啬c黏膜未培養(yǎng)細(xì)菌序列相似性達(dá)到100%，SDX107與黃牛瘤胃中未培養(yǎng)細(xì)菌序列相似性為99.6%，因此這些序列可能代表新的未培養(yǎng)的屬或種。

圖1 梅花鹿瘤胃細(xì)菌16S r RNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of bacteria 16S rRNA gene sequences from the rumen of sika deer

3 討論

瘤胃是一個(gè)含有大量微生物的厭氧生態(tài)系統(tǒng)，其中含有細(xì)菌 1010～1011個(gè)/mL、古菌 107～109個(gè)/mL、原蟲 104～106個(gè)/mL、真菌 103～106個(gè)/mL和病毒 109～ 1010個(gè)/mL［21］，這些微生物在降解植物纖維和含毒素植物中發(fā)揮著重要作用。在放牧狀態(tài)下，梅花鹿喜采食單寧含量高的柞樹葉。因此，對(duì)以柞樹葉為主要粗飼料的梅花鹿瘤胃細(xì)菌區(qū)系進(jìn)行分析，可為揭示梅花鹿耐受高單寧機(jī)制提供依據(jù)。

梅花鹿瘤胃細(xì)菌區(qū)系結(jié)果表明，87.9%的16S rRNA基因序列屬于與纖維降解密切相關(guān)的擬桿菌門，而Pope等［4］等發(fā)現(xiàn)挪威馴鹿瘤胃中61%細(xì)菌屬于擬桿菌門，這可能是因?yàn)閯?dòng)物種類或地理環(huán)境差異所導(dǎo)致。普雷沃氏菌屬是瘤胃中存在數(shù)量最為豐富的一類細(xì)菌［22－24］，它們可利用多種多糖，并可促進(jìn)木聚糖的降解［25－26］。梅花鹿瘤胃中87.9%的16S rRNA基因序列與普雷沃氏菌屬相似，而且明顯比奶牛(68.5%和 42% ～60%)［24，27］、山羊(19.7%)［22］和 羊駝(40%)［10］瘤胃中普雷沃氏菌屬比例高，這表明普雷沃氏菌屬在梅花鹿瘤胃發(fā)酵中發(fā)揮重要作用。盡管有研究認(rèn)為，飼糧中添加精飼料可能會(huì)導(dǎo)致普雷沃氏菌屬在瘤胃中數(shù)量增加［28－29］，但梅花鹿瘤胃中普雷沃氏菌屬的種類和數(shù)量更可能是梅花鹿與瘤胃內(nèi)微生物互相選擇、共同進(jìn)化的結(jié)果。

梅花鹿瘤胃中存在溶纖維丁酸弧菌，但未發(fā)現(xiàn)牛、羊瘤胃中常見的纖維素降解菌，如瘤胃球菌屬(Ruminococcus spp.)和琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogenes)。McSweeney 等［30］發(fā)現(xiàn)山羊采食含有單寧的危地馬拉朱纓花(Calliandra calothyrsus)后，瘤胃中瘤胃球菌屬和琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量減少，這說明單寧能夠影響瘤胃中纖維素降解菌的種類。因此，本研究中未檢測(cè)到瘤胃球菌屬和琥珀酸絲狀桿菌可能是因?yàn)樽鯓淙~中存在的單寧與瘤胃中細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞結(jié)合性胞外酶發(fā)生反應(yīng)，細(xì)菌可利用養(yǎng)分減少，生長受到抑制。而Jones等［31］報(bào)道，棲瘤胃普雷沃氏菌和梭菌屬(Clostridium spp.)細(xì)菌對(duì)縮合單寧具有耐受性，同時(shí)McSweeney等［32］發(fā)現(xiàn)同一種中不同菌株型對(duì)單寧表現(xiàn)出不同的耐受性。另外，由于普雷沃氏菌屬具有很高的遺傳多樣性［22］，因此，我們推測(cè)梅花鹿對(duì)單寧耐受性可能與瘤胃中大量存在的普雷沃氏菌屬有關(guān)。

序列分析結(jié)果表明梅花鹿瘤胃中存在Dialister succinatiphilus、Solobacterium moorei、Syntrophococcus sucromutans、糞便羅斯拜瑞氏菌、規(guī)則糞球菌和Sharpea azabuensis，這些細(xì)菌也發(fā)現(xiàn)于其他反芻動(dòng)物瘤胃中［23］。王夢(mèng)芝等［33］認(rèn)為瘤胃羅斯拜瑞氏菌屬(Roseburia sp.)的丁酰輔酶 A(CoA):乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶可轉(zhuǎn)化乙酸產(chǎn)生丁酸，形成菌種間的交互飼喂，保證瘤胃發(fā)酵的流暢性。糞球菌屬(Coprococcus sp.)具有降解間苯三酚的功能［34］?？紤]到單寧是一種酚類聚合物，所以，梅花鹿瘤胃中糞球菌屬也可能參與降解單寧的過程。有研究報(bào)道，單寧可以減少反芻動(dòng)物甲烷排放量［35－36］。因此，這些細(xì)菌可能在梅花鹿瘤胃中具有其他重要功能。因此，研究不同粗飼料對(duì)梅花鹿瘤胃中細(xì)菌多樣性的影響，將有助于理解梅花鹿對(duì)單寧的耐受機(jī)制。

4 結(jié)論

①本研究對(duì)以富含單寧的柞樹葉為主要粗飼料來源的梅花鹿瘤胃細(xì)菌多樣性進(jìn)行了初步分析，普雷沃氏菌屬是梅花鹿瘤胃內(nèi)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，但普雷沃氏菌屬相似克隆序列比例與其他反芻動(dòng)物有一定區(qū)別，可能是梅花鹿與瘤胃微生物互相選擇、共同進(jìn)化的結(jié)果。

②常見的纖維素降解菌未檢測(cè)到可能與飼料中單寧含量高有關(guān)。

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