胡春霞 易明花 陳 燃 陳慧來(lái)

(紹興文理學(xué)院 元培學(xué)院，浙江 紹興312000)

乳酸菌是能從可發(fā)酵性碳水化合物中產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的通稱(chēng)，廣泛存在于人類(lèi)、動(dòng)物腸道以及環(huán)境中[1〗.乳酸菌發(fā)酵食品作為一種營(yíng)養(yǎng)保健食品已被廣大消費(fèi)者所接受，泡菜就是以乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一.本研究從傳統(tǒng)自然發(fā)酵的泡菜中分離篩選出優(yōu)良乳酸菌菌種，通過(guò)混菌發(fā)酵試驗(yàn)研究其發(fā)酵性能，以期為生產(chǎn)乳酸菌純菌發(fā)酵劑、改進(jìn)傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵食品生產(chǎn)工藝提供技術(shù)與方法方面的參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大白菜、雪菜和卷心菜3種泡菜，均為紹興市地區(qū)民間傳統(tǒng)腌制的自然發(fā)酵泡菜；新鮮卷心菜市售.

草酸銨結(jié)晶紫染液：溶液A：結(jié)晶紫5 g、95%酒精20 mL；溶液B：草酸銨0.8 g；蒸餾水80 mL；將A、B溶液混合，用濾紙過(guò)濾后即可使用.

革蘭氏碘液：碘1.0 g，碘化鉀2.0 g，蒸餾水300 mL.

硫酸鋅溶液(0.42mol/L)；氫氧化鈉溶液(20g/L)；氯化銨緩沖溶液(pH值9.6～9.7)；顯色劑[2].亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液及亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液[3〗.以上試劑均為分析純.

1.2 儀器和設(shè)備

MJP-150恒溫培養(yǎng)箱；YXQ-LS-SII立式壓力蒸汽滅菌鍋；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)；LD24-1.2離心機(jī)；AR2130電子天平；PHS-3C精密酸度計(jì)；CX21BIM-SET5生物顯微鏡；HZQ-Q100全溫振蕩培養(yǎng)箱.

1.3 培養(yǎng)基

改良MRS液體培養(yǎng)基(菌種保藏、活化用培養(yǎng)基)：酵母膏浸出粉5 g，牛肉浸出粉10 g，KH2PO42 g，K2HPO42 g，檸檬酸銨2 g，醋酸鈉5 g，吐溫80 1 mL，葡萄糖20 g，維生素C 2 g，L-胱氨酸0.7 g，蛋白胨10 g，瓊脂15 g，MgSO41.15 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，加蒸餾水至1 L，pH值 6.4.

改良MRS固體培養(yǎng)基(分離用培養(yǎng)基)：在MRS液體培養(yǎng)基中加入1%的瓊脂.

1.4 方法

1.4.1 試驗(yàn)流程

泡菜汁→平板稀釋涂布分離→純化→挑單菌落編號(hào)保存→優(yōu)良菌株的篩選→乳酸菌菌株的鑒定→發(fā)酵應(yīng)用實(shí)驗(yàn)接種→泡菜發(fā)酵→發(fā)酵泡菜質(zhì)量評(píng)定.

1.4.2 乳酸菌的分離純化及初篩

采用10倍稀釋法將泡菜汁稀釋至10-5.選擇10-3、10-4、10-53個(gè)稀釋度，分別吸取稀釋液0.2 mL涂布于改良MRS培養(yǎng)基平板上.每個(gè)稀釋度2個(gè)平板，采用缸燭法加焦性沒(méi)食子酸改良法置35 ℃兼性厭氧培養(yǎng)48 h.挑取上述平板中長(zhǎng)勢(shì)良好的單個(gè)疑似菌落，在改良MRS培養(yǎng)基平板上劃線接種連續(xù)傳代4～6代獲得純化菌株，觀察菌落特征，并進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色實(shí)驗(yàn)，挑取革蘭氏陽(yáng)性、無(wú)芽孢的單菌落，轉(zhuǎn)至脫脂試管中35 ℃培養(yǎng)24 h，若牛初乳出現(xiàn)凝固，無(wú)氣泡，呈酸性，初步定為乳酸菌.

1.4.3 乳酸菌的復(fù)篩

乳酸的定性分析：取乳酸菌發(fā)酵液約5 mL于試管中，加入10% H2SO41 mL，再加入1mL 2% KMnO4溶液，此時(shí)乳酸轉(zhuǎn)化為乙醛，再將浸泡在含氨AgNO3溶液中的濾紙條取出放在試管上，將發(fā)酵液加熱至沸騰，若濾紙變黑則說(shuō)明有乳酸存在[4,5].

產(chǎn)酸率的測(cè)定：參照參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行，結(jié)果以乳酸百分含量表示：

乳酸菌發(fā)酵液酸度測(cè)定：同上方法滴定后，將所消耗的NaOH毫升數(shù)乘以10，即為中和100 mL發(fā)酵液所需的0.1 mol/L NaOH毫升數(shù)，消耗1 mL記為1oT.

用pH計(jì)直接測(cè)定上述發(fā)酵液的pH值.

1.4.4 乳酸菌菌株的生理生化鑒定

參考《微生物分類(lèi)學(xué)》[7]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中的試驗(yàn)方法[8〗，利用細(xì)菌微量生化反應(yīng)鑒定管對(duì)復(fù)篩出的菌株進(jìn)行生理學(xué)特性試驗(yàn).生化鑒定管購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司.

接觸酶(過(guò)氧化氫酶)反應(yīng)：取一環(huán)改良MRS斜面新鮮培養(yǎng)物涂在干凈載玻片上，在菌體上滴加一滴 3 %過(guò)氧化氫，觀察是否有氣泡產(chǎn)生(2～3 min) .

硝酸鹽還原試驗(yàn)：將乳酸菌菌株接種到蛋白胨水培養(yǎng)基中，35 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，再將檢測(cè)試劑A(磺胺酸冰醋酸溶液)和B(α-萘胺乙醇溶液)試液各0.2 mL等量混合后，取0.1 mL加入液體培養(yǎng)物中，10 min內(nèi)觀察是否呈現(xiàn)紅色.

糖發(fā)酵試驗(yàn)：取阿拉伯糖、阿拉伯醇、甘露醇、肌醇、棉籽糖、葡萄糖、10%乳糖、OF(氧化發(fā)酵)、乳糖、麥芽糖、ONPG(β-半乳糖苷酶)、果糖、木糖、明膠、紫牛乳發(fā)酵管，用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑取純培養(yǎng)物單個(gè)菌落接種，置于35 ℃下培養(yǎng)24～48 h，觀察發(fā)酵管有無(wú)變色現(xiàn)象.

1.4.5 發(fā)酵劑的制備

將經(jīng)過(guò)復(fù)篩和生化鑒定的優(yōu)良乳酸菌菌種分別轉(zhuǎn)接活化，擴(kuò)大培養(yǎng)(培養(yǎng)至菌落濃度約為1.0×107CFU/mL)，3500 r/min離心15 min，棄掉上清液，用無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體，以此作為接種卷心菜的純種發(fā)酵劑.

1.4.6 乳酸菌應(yīng)用研究

卷心菜乳酸發(fā)酵：清洗干凈，無(wú)菌條件進(jìn)行適當(dāng)切分，接種發(fā)酵劑(5 %的接種量)，注入4 %食鹽水(加以適量的調(diào)料)發(fā)酵(37 ℃，3 d).試驗(yàn)設(shè)純種發(fā)酵組(熱燙處理卷心菜)、自然發(fā)酵組(不作熱燙處理卷心菜)，純種發(fā)酵組包括單菌種發(fā)酵組和混菌發(fā)酵組.泡菜從氣味、風(fēng)味、口感、脆性、顏色等感官指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)定[9〗，測(cè)定活菌總數(shù)、亞硝酸鹽的含量、pH值等指標(biāo)，與自然發(fā)酵組進(jìn)行比較.

1.4.7 亞硝酸鹽測(cè)定

測(cè)定原理：在弱酸酸化條件下，亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生重氮反應(yīng)，然后與N-1-萘基乙二胺偶合形成紫紅色染料，呈色深淺與亞硝酸鹽含量成正比[10〗，在一定波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作、樣品制備及亞硝酸鹽的測(cè)定參照梁慧鋒的方法[11〗.利用下式計(jì)算亞硝酸鹽含量[12〗：

ω=χν1/mν2.

式中，ω為樣品中亞硝酸的含量(μg/g)；m為取樣質(zhì)量(g)；χ為樣品液中與標(biāo)準(zhǔn)系列中相當(dāng)量的亞硝酸鹽(μg)；ν1為樣品處理液的總體積(mL)；ν2為測(cè)定用樣液的體積(mL).

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)良乳酸菌的篩選

經(jīng)過(guò)多次分離純化，共從3種泡菜樣品中獲得14株長(zhǎng)勢(shì)良好、菌落特征與乳酸菌相似的菌株，分別編號(hào)為A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、B1、B2、B3、B4、B5、B6.通過(guò)試驗(yàn)篩選出10株革蘭氏陽(yáng)性、無(wú)芽孢的純菌株A1、A3、A4、A6、A8、B2、B3、B4、B5、B6，經(jīng)乳酸定性分析和產(chǎn)酸量定量分析發(fā)現(xiàn)其中有10個(gè)菌株發(fā)酵液中含有乳酸，初步說(shuō)明分離獲得的10個(gè)菌株為產(chǎn)乳酸菌.從表1中可以看出，A1、 B3、B4三個(gè)菌株產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，可作為備選菌株.

表1 各菌株產(chǎn)乳酸的定性分析及其產(chǎn)酸量的定量分析

注：+ 陽(yáng)性反應(yīng)，即產(chǎn)乳酸

2.2 菌株A1、 B3、B4的形態(tài)學(xué)特征

經(jīng)菌落形態(tài)特征觀察結(jié)果(表2)顯示，所選產(chǎn)酸較高的A1、 B3、B4菌株均為無(wú)芽孢桿菌，形態(tài)特征和乳酸菌相符.

表2 乳酸菌篩選菌株的形態(tài)特征

2.3 菌株A1、 B3、B4的生化特征

進(jìn)一步對(duì)這3株菌進(jìn)行生化鑒定結(jié)果如表3所示，依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，凡是革蘭氏染色陽(yáng)性、觸酶試驗(yàn)陰性、硝酸還原試驗(yàn)陰性、石蕊牛乳試驗(yàn)陽(yáng)性，在改良MRS培養(yǎng)基上菌落周?chē)纬擅黠@的透明環(huán)的分離菌，可初步判定為乳酸菌.再綜合形態(tài)學(xué)、生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果，可初步確定菌株A1屬于保加利亞乳桿菌，B3屬于短乳桿菌，B4屬于嗜酸乳桿菌.

表3 乳酸菌篩選菌株的生理生化鑒定特征

續(xù)表：

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目A1B3B410%乳糖+++OF+++乳糖-++麥芽糖-++ONPG---果糖+++木糖醇-+-蔗糖-++明膠---

注：“+”代表陽(yáng)性；“-”代表陰性

2.4 菌株對(duì)發(fā)酵卷心菜泡菜品質(zhì)的影響

2.4.1 感官評(píng)定

利用分離鑒定出的三種菌株A1、 B3、B4設(shè)置純種發(fā)酵、兩兩菌株混菌發(fā)酵以及三菌株混菌發(fā)酵組發(fā)酵制備卷心菜泡菜，運(yùn)用感官評(píng)定結(jié)果表明(表4)：純種發(fā)酵泡菜味道較自然發(fā)酵的好，混菌發(fā)酵泡菜的風(fēng)味要優(yōu)于純種發(fā)酵泡菜，其中三菌株混菌發(fā)酵泡菜的各項(xiàng)品評(píng)項(xiàng)目均為最優(yōu)，而純種發(fā)酵中B4菌株發(fā)酵出來(lái)的泡菜口味稍差.

表4 卷心菜泡菜的感官評(píng)定

2.4.2 pH值測(cè)定

分別測(cè)定混菌發(fā)酵、純種發(fā)酵及自然發(fā)酵組24 h、48h和72h三個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間的pH值，結(jié)果如表5所示.從表5可以發(fā)現(xiàn)，純種發(fā)酵的泡菜pH值在48 h的時(shí)候已經(jīng)降到3.5以下，而自然發(fā)酵組在72 h時(shí)才降到相近pH值，因而人工接種發(fā)酵泡菜可明顯縮短發(fā)酵周期.另外，混菌發(fā)酵的泡菜在48 h時(shí)pH值明顯低于純種發(fā)酵.一般將泡菜pH值降至3.5時(shí)，認(rèn)為泡菜發(fā)酵成熟.因此，使用純菌或混菌發(fā)酵劑可大大縮短發(fā)酵周期，節(jié)省時(shí)間.

表5 各發(fā)酵組不同時(shí)期的pH值測(cè)定

2.4.3 活菌計(jì)數(shù)

分別取混菌發(fā)酵、純種發(fā)酵及自然發(fā)酵各組在24 h、48h和72h時(shí)的發(fā)酵液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表6.由表6可知，人工發(fā)酵1～2天活菌數(shù)量處于增長(zhǎng)趨勢(shì)；48 h后活菌數(shù)量平緩或減少，而自然發(fā)酵活菌數(shù)量在72 h內(nèi)一直處于增長(zhǎng)趨勢(shì).說(shuō)明接種一定量的乳酸菌發(fā)酵劑后，活菌數(shù)量高，利于泡菜的發(fā)酵.

表6 各發(fā)酵組不同時(shí)期的菌落計(jì)數(shù)

2.4.4 亞硝酸鹽測(cè)定

以亞硝酸鹽濃度為縱坐標(biāo)，不同濃度亞硝酸鹽的吸光度為橫坐標(biāo)，得到亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線( 圖1).由圖1可知，亞硝酸鹽濃度與吸光度的線性關(guān)系良好，回歸方程為χ=51.802A -0.0901(R2=0.9978)，其中χ指亞硝酸鹽含量，A指吸光度.

表7各發(fā)酵組不同時(shí)期的亞硝酸鹽含量

發(fā)酵組別亞硝酸鹽含量(μg/g)第一天第二天第七天自然發(fā)酵組20.8315.387.72A1菌株純種發(fā)酵組5.413.121.53B3菌株純種發(fā)酵組6.584.073.47B4菌株純種發(fā)酵組5.234.612.15A1、B3混菌發(fā)酵組3.172.080.59A1、B4混菌發(fā)酵組3.021.200.41B3、B4混菌發(fā)酵組3.282.310.60A1、B3、B4混菌發(fā)酵組3.112.180.39

從表7 可以看出，在自然發(fā)酵泡菜中亞硝酸鹽含量明顯高于人工發(fā)酵的泡菜，第一天亞硝酸鹽含量最高為20.83 μg/g，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，亞硝酸鹽含量迅速降低至7.72 μg/g.而人工發(fā)酵泡菜從第一天開(kāi)始直到成熟，亞硝酸含量不明顯，其中三菌株混菌發(fā)酵組第7天時(shí)亞硝酸鹽含量為0.39 μg/g，比自然發(fā)酵的降低94.95%.

3 結(jié)論

泡菜是一種常見(jiàn)的乳酸菌發(fā)酵食品.一直以來(lái)，傳統(tǒng)高鹽腌制泡菜加工工藝生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本較高和風(fēng)味差的缺點(diǎn)限制著泡菜的工業(yè)化發(fā)展.而低鹽腌制的泡菜又存在著品質(zhì)不穩(wěn)定、亞硝酸鹽含量容易超標(biāo)，容易污染有害微生物等缺點(diǎn)、因此人工接種發(fā)酵泡菜就成為大家研究的方向.

研究發(fā)現(xiàn)，人工接種菌種發(fā)酵泡菜，不僅可以提高泡菜的口感，還可大大降低泡菜中亞硝酸鹽殘留量.這是因?yàn)?，隨著泡菜腌制時(shí)間的延長(zhǎng)，泡菜的pH值降低，促進(jìn)了亞硝酸鹽的降解，使泡菜中亞硝酸鹽的含量降低.而人工接種乳酸菌的含量遠(yuǎn)高于自然發(fā)酵泡菜中的乳酸菌含量，發(fā)酵乳酸生成快，使環(huán)境中的pH值迅速降低，抑制或殺死其中一些不賴(lài)酸的病原菌及有害菌生長(zhǎng)[13].同時(shí)，硝酸還原酶的適宜pH值為7.0～7.5，隨著環(huán)境酸度增加，pH值降低，還原酶活性降低，甚至無(wú)活性，促使亞硝酸鹽降解，從而減少亞硝酸鹽與二級(jí)胺反應(yīng)生成致癌物質(zhì)—亞硝胺[1,4,15〗.

本試驗(yàn)從紹興地區(qū)三種民間傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中分離優(yōu)選出3株高產(chǎn)酸菌株A1、 B3和B4，經(jīng)形態(tài)學(xué)及生化特性初步鑒定，3株分別是短乳桿菌、嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌.

泡菜是以各種時(shí)鮮蔬菜為原料，入泡浸液經(jīng)乳酸菌發(fā)酵泡浸成菜。因此本實(shí)驗(yàn)以卷心菜為代表對(duì)這三株菌進(jìn)行發(fā)酵性能的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人工接種發(fā)酵泡菜可以很好解決蔬菜低鹽腌制發(fā)酵過(guò)程中品質(zhì)不穩(wěn)定、亞硝酸鹽含量超標(biāo)等問(wèn)題；而且和自然發(fā)酵、單菌株發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵解決人工接種單菌發(fā)酵泡菜口感較差，風(fēng)味不夠豐厚飽滿(mǎn)的缺點(diǎn)，是一條值得繼續(xù)探索的途徑.

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