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(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 大連 116027)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

阿托伐他汀對(duì)膿毒癥大鼠C反應(yīng)蛋白的影響

顧金萍，于健,王之余，曲茂興

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 大連 116027)

目的觀察阿托伐他汀對(duì)膿毒癥大鼠血中C反應(yīng)蛋白(CRP)濃度的影響，探討他汀類藥物是否影響宿主炎癥反應(yīng)。方法選擇健康雄性S-D(Sprague-Dawley)大鼠100只，采用盲腸結(jié)扎法(CLP)制造大鼠膿毒癥模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、膿毒癥組、阿托伐他汀低劑量組和阿托伐他汀高劑量組，各組25只。于術(shù)后0 h,3 h,6 h,12 h和24 h采血，分離血漿檢測(cè)CRP的濃度。觀察和比較各組大鼠活動(dòng)度，小腸組織病理改變。采用SPSS13.0軟件包，于各時(shí)間點(diǎn)行重復(fù)測(cè)量資料方差分析。結(jié)果0 h各組大鼠血漿CRP濃度比較差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。對(duì)照組血漿CRP濃度在各時(shí)間點(diǎn)變化不明顯，在3 h、6 h、12 h、24 h阿托伐他汀低劑量組、阿托伐他汀高劑量組的血漿CRP濃度較膿毒癥組和對(duì)照組比較差異均有顯著性意義，明顯低于膿毒癥組(P<0.01)，阿托伐他汀高劑量組較阿托伐他汀低劑量組血漿CRP濃度降低更明顯(P<0.01)。膿毒癥組大鼠膿毒癥表現(xiàn)最強(qiáng)，阿托伐他汀組膿毒癥表現(xiàn)明顯減輕，高劑量組較低劑量組減輕更為明顯，對(duì)照組沒(méi)有相關(guān)表現(xiàn)。結(jié)論阿托伐他汀能抑制膿毒癥大鼠CRP釋放，降低血漿CRP的水平。

膿毒癥；阿托伐他??；C反應(yīng)蛋白(CRP)；大鼠

膿毒癥(Sepsis)是由感染引起的臨床疾病，為機(jī)體局部感染，毒素吸收或者病原微生物直接入血彌漫全身所致，是嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、感染、外科大手術(shù)患者常見(jiàn)的并發(fā)癥，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征，是臨床危重患者最主要的死亡原因之一[1]，而Sepsis是否引起死亡主要取決于機(jī)體對(duì)炎癥的反應(yīng)及其炎癥因子的釋放。目前，對(duì)膿毒癥的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，病因治療、液體復(fù)蘇、血管活性藥物治療、抗生素的使用及抗凝治療等仍然是目前的主要治療手段，盡管上述治療手段不斷改進(jìn)，但膿毒癥或膿毒性休克的死亡率仍居高不下，為30%～50%[2]。

他汀類藥物(statins)是羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，此類藥物通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制內(nèi)源性膽固醇合成限速酶(HMG-CoA)還原酶，阻斷細(xì)胞內(nèi)羥甲戊酸代謝途徑，使細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成減少。同時(shí)，他汀類藥物可刺激肝臟細(xì)胞，使其攝取膽固醇及其前體增加，從而降低血膽固醇濃度，是治療心腦血管病的必備藥物。他汀類藥物同時(shí)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞，血小板，平滑肌及炎癥過(guò)程等均有作用。近期的研究顯示他汀類藥物對(duì)內(nèi)毒素血癥的患者有益，一項(xiàng)前瞻性研究證實(shí)，患有急性細(xì)菌感染的患者，若預(yù)先服用他汀類藥物，則嚴(yán)重膿毒癥的發(fā)病率及ICU住院率均下降[3]。一項(xiàng)回顧性分析報(bào)道，在388例感染需氧革蘭陰性桿菌和金黃色葡萄球菌的患者中，服用他汀類藥物的患者死亡率明顯低于未服用的患者[4]。

另一項(xiàng)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)制作了膿毒癥小鼠模型，于膿毒癥發(fā)生前后均給予他汀類藥物，發(fā)現(xiàn)其生存率明顯高于對(duì)照組[5]。由于膿毒癥是細(xì)菌感染的嚴(yán)重階段，涉及到多種炎癥因子的釋放，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)，白細(xì)胞介素1、6、8(IL-1,IL-6,IL-8)等,而他汀類藥物改善患者的預(yù)后可能與抑制炎癥因子的釋放有關(guān)[1]。本研究的目的是觀察他汀類藥物對(duì)膿毒癥小鼠血漿CRP濃度的影響，從而進(jìn)一步明確他汀類藥物干預(yù)炎癥過(guò)程的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備

DS-88型電子秤(武漢自動(dòng)化儀表廠)，TG16WS高速臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙科學(xué)儀器廠)， HH-W21-600電熱恒溫水浴箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)，邁瑞MR96A酶標(biāo)儀。

1.2 試劑和材料

阿托伐他汀(立普妥)，20 mg/片，大連輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)081128。麻醉劑：3%戊巴比妥鈉。制作模型的耗材：愛(ài)惜康(黑色)編織非吸收性縫線，15 cm×60 cm，由Johnson 公司生產(chǎn)。凱基大鼠CRP ELISA 試劑盒，由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

100只健康雄性S-D大鼠，體質(zhì)量184～202 g，購(gòu)于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)，環(huán)境溫度22～25 ℃，空氣濕度40%～70%。每5只大鼠置一籠(475 mm×300 mm×200 mm)，在籠內(nèi)自由活動(dòng)，攝取全價(jià)配合飼料并自由飲水，自然長(zhǎng)度的晝夜循環(huán)。按照隨機(jī)排列表法分為對(duì)照組，膿毒癥組，阿托伐他汀低劑量組，阿托伐他汀高劑量組，每組25只。對(duì)照組用淀粉40 mg/(kg·d)加入2 mL生理鹽水制成混懸液灌胃5 d，術(shù)前禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉，無(wú)菌條件下取下腹正中切口2 cm，翻動(dòng)盲腸后還納腹腔，逐層縫合切口，置籠內(nèi)活動(dòng)，不禁飲食。膿毒癥組術(shù)前灌胃與對(duì)照組相同，采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)制作膿毒癥大鼠模型。阿托伐他汀組低劑量用研缽粉碎阿托伐他汀，以20 mg/(kg·d)加入2 mL生理鹽水制成混懸液連續(xù)灌胃5 d，采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)制作膿毒癥大鼠模型。阿托伐他汀組高劑量用研缽粉碎阿托伐他汀，以40 mg/(kg·d)加入2 mL生理鹽水制成混懸液連續(xù)灌胃5 d，采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)制作膿毒癥大鼠模型。大鼠的給藥量參照劉福英，劉田福主編的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》[6]。

1.4 盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)

術(shù)前禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉，無(wú)菌條件下取下腹正中切口2 cm，暴露盲腸，用絲線結(jié)扎盲腸總長(zhǎng)度的30%[7]，注意避開(kāi)系膜血管，9號(hào)注射針頭在盲腸游離端選2個(gè)相距3 mm點(diǎn)分別刺孔穿透盲腸，然后將盲腸還納腹腔，逐層縫合切口，即刻皮下注射生理鹽水3 mL/100 g體重以補(bǔ)充術(shù)中丟失的液體。術(shù)后置籠內(nèi)活動(dòng)，不禁飲食。

1.5 大鼠膿毒癥嚴(yán)重程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

采用改良的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行評(píng)分。見(jiàn)表1。

1.6 標(biāo)本收集

24 h 各取5只大鼠麻醉后，剪去一側(cè)頸部外側(cè)被毛，剪開(kāi)皮膚，剝離組織，找到頸靜脈或動(dòng)脈后，使各組分別在術(shù)后0 h，3 h，6 h，12 h,用注射器采血，在采血管中在靜置30 min,4 ℃以4 000 r/min離心15 min,分離出血漿后于-80 ℃冰箱中保存。

1.7 標(biāo)本檢測(cè)

CRP應(yīng)用凱基大鼠 CRP ELISA 試劑盒測(cè)定。

1.8 組織病理觀察

各組分別在術(shù)后0、24 h取空腸標(biāo)本，置10%甲醛溶液中固定，依次進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、制成切片、蘇木精-伊紅(HE)染色后，光鏡下檢查組織病理學(xué)改變。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正態(tài)分布變量多組間的比較用方差分析，非正態(tài)分布變量用秩和檢驗(yàn)，四個(gè)處理組之間均數(shù)兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 大鼠CLP后膿毒癥嚴(yán)重程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況

膿毒癥大鼠逐漸出現(xiàn)活動(dòng)少，不再扎堆取暖，冷漠，皮毛失去光澤，停止飲水，豎毛，有些大鼠呼吸快，眼睛變雙環(huán)，對(duì)被動(dòng)仰臥無(wú)反抗，感覺(jué)遲鈍，短期內(nèi)病死率高。腹腔腸系膜充血，腸管顯著擴(kuò)張，結(jié)扎盲腸壞死，血性腹水，病灶處大網(wǎng)膜包裹不佳，肝腫大，肺表面充血明顯等。 低劑量組出現(xiàn)厭食，豎毛，活動(dòng)少甚至不活動(dòng)等情況，腸管輕度擴(kuò)張，腹水微臭，壞死盲腸被大網(wǎng)膜及周圍腸管包裹良好，但局部可見(jiàn)壞死，高劑量組亦出現(xiàn)厭食，豎毛，活動(dòng)少等情況，腸管輕度擴(kuò)張腹水減少，壞死盲腸被大網(wǎng)膜及周圍腸管包裹明顯，對(duì)照組沒(méi)有相關(guān)表現(xiàn)。各組大鼠膿毒癥嚴(yán)重程度評(píng)分見(jiàn)表2。

2.2 各組血漿CRP濃度的比較

0 h各組動(dòng)物血漿CRP濃度比較差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。對(duì)照組血漿CRP濃度在各時(shí)間點(diǎn)變化不明顯，在3 h、6 h、12 h、24 h阿托伐他汀低劑量組、阿托伐他汀高劑量組的血漿CRP濃度與膿毒癥組和對(duì)照組比較差異均有顯著性意義，明顯低于膿毒癥組(P<0.01)，阿托伐他汀高劑量組較阿托伐他汀低劑量組血漿CRP濃度降低更明顯(P<0.01)。見(jiàn)表3。

2.3 大鼠大體解剖檢查

對(duì)照組無(wú)明顯病理改變。膿毒癥組均有嚴(yán)重的腹腔炎癥，腹腔內(nèi)有多量渾濁膿性滲出液，可見(jiàn)有血性腹水，腸管水腫粘連，盲腸腫脹壞疽，肝腎充血腫大。阿托伐他汀組膿性滲出液略少，腸管粘連較膿毒癥組輕，盲腸腫脹壞疽減輕。高劑量組較低劑量組膿性滲出液少，盲腸腫脹壞疽輕。

2.4 光學(xué)顯微鏡下小腸的病理改變

對(duì)照組腸黏膜正常。膿毒癥組腸黏膜部分上皮脫落，重度炎癥。阿托伐他汀組腸黏膜中度炎癥。見(jiàn)圖1。

3 討 論

自從膿毒癥被描述到現(xiàn)在，由于其復(fù)雜的臨床過(guò)程加大了治療的難度，其死亡率一直居高不下。雖然近年來(lái)對(duì)人體的病理生理有了突破性的認(rèn)識(shí)，并采取了一些創(chuàng)新的治療技術(shù)，但是重癥膿毒癥的死亡率仍然保持在40%[9]，在合并臟器衰竭和休克的患者，有些甚至已超過(guò)了50%。

CRP是機(jī)體受到微生物入侵或組織損傷等炎癥性刺激時(shí)肝細(xì)胞合成的急性期蛋白。CRP是機(jī)體非特異性免疫機(jī)制的一部分，它結(jié)合C-多糖，在Ca2+存在時(shí)可結(jié)合細(xì)胞膜上磷酸膽堿，可激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑，增強(qiáng)白細(xì)胞的吞噬作用，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞或單核/巨噬系統(tǒng)功能，促進(jìn)巨噬細(xì)胞組織因子的生成。人CRP主要生物學(xué)功能：通過(guò)與配體(凋亡與壞死的細(xì)胞，或入侵的細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)等的磷酰膽堿)結(jié)合，激活補(bǔ)體和單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，將載有配體的病理物質(zhì)或病原體清除。識(shí)別外來(lái)物質(zhì)，激活補(bǔ)體系統(tǒng)。增強(qiáng)調(diào)理作用，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞吞噬作用。與血小板激活因子(RAF)結(jié)合，降低炎癥反應(yīng)。與染色體結(jié)合，消除壞死組織里的細(xì)胞DNA[10]。

表2 四組大鼠膿毒癥嚴(yán)重程度評(píng)分比較

1)與對(duì)照組相比，P<0.01，2)與膿毒癥組相比，P<0.01，3)與低劑量組比，P<0.01

表3 阿托伐他汀對(duì)膿毒癥大鼠血漿CRP濃度的影響

1)與對(duì)照組相比，P<0.01；2)與膿毒癥組相比，P<0.01；3)與低劑量組相比，P<0.05

圖1 大鼠小腸24 h病理改變(HE ×200)

CRP在炎癥開(kāi)始數(shù)小時(shí)就升高，48 h即可達(dá)峰值，隨著病變消退、組織、結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)降至正常水平。此反應(yīng)不受放療、化療、皮質(zhì)激素治療的影響。因此，CRP的檢測(cè)在臨床應(yīng)用相當(dāng)廣泛，包括急性感染性疾病的診斷和鑒別診斷。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可以抑制炎性因子的釋放，抑制炎性細(xì)胞的粘附，降低膿毒血癥的發(fā)生率和病死率。Thomsen等[11]研究指出，菌血癥患者的短期病死率沒(méi)有影響，但是卻可以明顯改善細(xì)菌感染后30～180 d的病死率 。雖然目前大多數(shù)的研究結(jié)果支持他汀類藥物能改善膿毒血癥的預(yù)后，但需要有大樣本的前瞻性的隨機(jī)對(duì)照研究結(jié)果來(lái)證實(shí)。他汀類藥物可降低膿毒癥患者的病死率，其中主要機(jī)制之一可能與保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能有關(guān)。他汀類藥物是羥甲基戊二酸輔酶A(HMGCoA)還原酶抑制劑，干擾膽固醇代謝，是目前廣泛應(yīng)用的降脂藥物，臨床上主要用于高脂血癥、冠心病等。越來(lái)越多研究顯示，他汀類藥物不但有降脂作用，還能降低膿毒癥患者的病死率[12]。他汀類藥物成為近年膿毒癥治療研究的熱點(diǎn)，其主要機(jī)制之一可能與保護(hù)血管內(nèi)皮功能有關(guān)。他汀類藥物對(duì)膿毒癥的有益作用首先在一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到證明。Merx等[5]采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)復(fù)制小鼠膿毒癥模型,研究表明,經(jīng)過(guò)他汀類藥物預(yù)處理的小鼠的平均存活率是對(duì)照組的4倍。有臨床觀察研究表明，他汀類藥物治療對(duì)膿毒癥患者有益。Kruger等[13]對(duì)438例患者66例 (占總?cè)巳旱?5%)入院前正在服用他汀類藥物，而且其中85%患者入院后仍繼續(xù)接受他汀類藥物治療進(jìn)行的回顧性調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物治療對(duì)膿毒癥患者有益，他汀治療組與對(duì)照組相比，28 d總病死率(10.6%vs 23.1%，P=0.022)和由膿毒癥所致的病死率(6.1% vs 18.3%,P=0.014)顯著下降。Alomog等[14]在對(duì)肺炎、泌尿系感染和蜂窩織炎患者(這些患者的APACHEⅡ評(píng)分11.1±7.2)的前瞻性隊(duì)列研究中也表明，他汀類藥物可降低嚴(yán)重膿毒癥發(fā)生率和ICU住院率。

臨床研究資料顯示他汀類藥物能夠顯著降低患者體內(nèi)的多種炎癥介質(zhì)，從而抑制炎癥細(xì)胞因子、趨化因子及黏附分子的表達(dá)，降低CRP的水平。在Reversal試驗(yàn)中阿托伐他汀具有更強(qiáng)的降低CRP的作用。在新近發(fā)表的TARA研究表明，阿托伐他汀治療6個(gè)月后病變活躍積分(DAS28)顯著改善，CRP及ESR指標(biāo)同樣有顯著改善。大量臨床研究提示他汀類藥物具備獨(dú)特的抗炎效果[15]。其抗炎作用機(jī)制主要包括減弱炎癥細(xì)胞向斑塊內(nèi)趨化聚集、抑制巨噬細(xì)胞可溶性細(xì)胞間黏附分子以及金屬蛋白酶的表達(dá)等，其中減少巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞介素-6(IL-6)的合成是主要機(jī)制。目前不少研究的結(jié)果也提示他汀類藥物的抗炎作用與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，膿毒癥組CRP指標(biāo)較阿托伐他汀組均明顯升高，阿托伐他汀高劑量組的CRP指標(biāo)低于低劑量組，考慮阿托伐他汀可能具有抗膿毒癥作用。希望逐漸把相關(guān)的研究應(yīng)用于臨床，對(duì)膿毒癥的治療帶來(lái)益處。

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EffectsofAtorvastatinonlevelsofC-responseproteininsepsisrats

GUJin-ping,YUJian,WANGZhi-yu,QUMao-xing

(IntensiveCareUnit,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China)

ObjectiveTo investigate the influences of atorvastatin on C-response protein (CRP) of rats with sepsis. To discuss whether the statins would affect the host response to inflammation.MethodsSepsis models were establishing using 100 male SD rats. The rats were manufactured models by cecal ligation and puncture (CLP). A total of 100 healthy rats randomly were divided into 4 groups (n=25): Sham-operation group,CLP group,low-dose atorvastatin group and high-dose atorvastatin group. Blood samples of five rats in each group were collected at postoperative 0,3,6,12 and 24 hours to detect CRP in plasma. We observed and compared the activity of rats in each group. Specimens of small intestine were taken for pathological examination by optical microscope.ResultsAt 0 h,plasma CRP levels were not significantly different among the groups.CRP levels in low-dose and high-dose atorvastatin groups were both significantly lower at postoperative 3,6,12 and 24 hours (P<0.01) than those in CLP group. CRP levels in high-dose atorvastatin group were significantly lower than those in low-dose group (P<0.01) at the four time points.ConclusionAtorvastatin could inhibit the expression of CRP in blood plasma of sepsis rats,and might have anti-septic effect.

sepsis; atorvastatin; C response protein; rat

10.11724/jdmu.2013.06.06

R631

A

1671-7295(2013)06-0533-05

顧金萍，于健,王之余，等.阿托伐他汀對(duì)膿毒癥大鼠C反應(yīng)蛋白的影響[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,35(6)：533-537.

大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院院內(nèi)青年科研基金項(xiàng)目(2008)

顧金萍(1976-)，女，山東陵縣人,副主任醫(yī)師,碩士。E-mail:gjpking5460@163.com

于 健，教授。E-mail:yujian@medmail.com.cn

2013-09-11；

2013-11-10