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(上海大學(xué) 上海市能源作物育種及應(yīng)用重點實驗室 上海200444)

0 引 言

擬南芥是一種十字花科植物,由于其基因組較小、生長周期短、容易種植等特點深受眾多研究學(xué)者喜愛,是當今生物學(xué)研究的熱門模式，為多數(shù)實驗室和研究機構(gòu)的研究對象.花是植物中最后重要的器官之一,而花藥在植物花發(fā)育中占有重要地位[1].研究表明,擬南芥的花藥及小孢子發(fā)育在時空上受到精確調(diào)控,使花藥從分生組織逐步分化、成熟并最終釋放花粉[1-2].ACOS5是擬南芥花藥中特異表達的一種基因,該基因編碼一種脂酰輔酶A合成酶,該酶能夠在有輔酶A存在的情況下消耗ATP將肉桂酸、油酸等合成肉桂酰輔酶A和油酰輔酶A[3].其主要參與擬南芥花藥絨氈層的形成及發(fā)育,若該基因無意突變會直接導(dǎo)致擬南芥雄性不育[2-3].如果在模式植物擬南芥中能夠探明ACOS5的基因表達模式,將有助于在水稻、小麥等其他糧食和經(jīng)濟作物中應(yīng)用.

1 材 料

1.1 植物材料

擬南芥Columbia生態(tài)型,于人工光照溫室培養(yǎng),培養(yǎng)條件為溫度22℃,16 h光照,8 h黑暗[4].定期進行澆水和營養(yǎng)液澆灌.營養(yǎng)液由上海永通化工有限公司生產(chǎn).

2 方 法

2.1 基因組抽提

基因組抽提采用康為世紀植物復(fù)雜基因組抽提試劑盒進行抽提.

2.2 ACOS5啟動子克隆

自www.arabidopsis.org下載ACOS5啟動子序列,長度選取轉(zhuǎn)錄起始點至上游3Kbp.根據(jù)啟動子序列設(shè)計引物,上下游引物兩端分別加入HidIII和Sac1酶切位點.引物合成由上海生工生物工程公司進行合成.

引物序列為:上游(HindIII) CCCAAAGCTTGTAGAGGCTGAGAAATTGTA

下游(SacI) CGGAGCTCGATTTATGTGTTAGGAACAGGG

采用PCR方法對目的序列進行擴增,擴增采用takara公司生產(chǎn)的KOD PCR擴增試劑盒.PCR擴增參數(shù)為:

將所擴增的目的片段用taq酶進行加A,加A后進行膠回收操作.膠回收采用takara公司生產(chǎn)的膠回收試劑盒.

2.3 基因測序

將所回收得到的目的片段連入pMD18-T載體進行測序,該產(chǎn)品由TAKARA公司生產(chǎn).測序公司為上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司.

連接體系(10 μL)如下:

Solution I內(nèi)含T4 DNA連接酶,為試劑盒內(nèi)配套試劑.

2.4 GFP基因克隆

實驗室自有GFP-T質(zhì)粒.通過設(shè)計引物進行PCR,PCR產(chǎn)物回收加A后連入T載體進行測序.

引物序列為:上游(BamHI):CGCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA

下游(SalI):GCGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCC

PCR擴增參數(shù)為

連接體系(10μL)如下:

挑選陽性克隆后送上海美吉生物公司進行測序.

2.5 表達載體構(gòu)建

以下為實驗室自有p1300載體圖譜.

圖1 p1300載體多克隆位點示意圖

首先,將P1300載體以HindIII、SacI進行酶切并回收載體片段.然后,將測序正確的ACOS5啟動子以HindIII、SacI自T載體上酶切,并回收連入P1300載體中,并進行陽性克隆篩選和鑒定.將鑒定的載體以BamHI、SalI進行酶切,并回收載體片段備用.將測序正確的GFP基因以BamHI、SalI進行酶切并回收,隨后連入上述BamHI、Sal I處理的載體中并進行陽性克隆篩選和鑒定.

GFP連接體系(10 μL)如下:

ACOS5連接體系(10μL)如下:

將兩個目的片段分別連入p1300載體后挑選陽性克隆并抽提質(zhì)粒進行酶切鑒定,剩余質(zhì)粒備用.

2.6 轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌

將構(gòu)建好的載體熱激轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌GV3101中.轉(zhuǎn)化方法詳見參考文獻[5-7].隨后進行農(nóng)桿菌陽性克隆篩選及鑒定.

2.7 轉(zhuǎn)基因

將已轉(zhuǎn)入載體的農(nóng)桿菌陽性克隆進行劃板、挑選單克隆、小型搖培(5 mL)、中型搖培(200 mL)后進行轉(zhuǎn)基因操作.轉(zhuǎn)基因具體步驟詳見參考文獻[5-8].

2.8 陽性苗篩選

轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化后3個月收集種子,對種子進行干燥.于50 μg/mL的潮霉素抗性平板上進行陽性苗篩選.并將所篩選到的陽性苗移出至人工光照培養(yǎng)箱進行培養(yǎng).

2.9 熒光觀察

以蔡司LSM710共聚焦顯微鏡對篩選陽性苗進行熒光鑒定及表型觀察,并采用蔡司2.0圖形分析軟件對拍攝圖片進行熒光定量分析,統(tǒng)計不同時期花藥內(nèi)GFP的表達情況.

3 結(jié) 果

3.1 啟動子克隆

將ACOS5啟動子、GFP基因測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站與原始序列進行比對,測序結(jié)果與原始序列完全匹配,無錯配、缺失等.

3.2 載體構(gòu)建

對構(gòu)建好的p1300陽性克隆進行質(zhì)粒抽提和酶切鑒定.分別采用HindIII、SacI對ACOS5啟動子,BamHI、Sal I對GFP進行酶切鑒定,分別切出3Kbp條帶和750 bp條帶及剩余載體帶.鑒定結(jié)果如圖2,3所示:

圖2 ACOS5啟動子酶切鑒定

圖3 GFP酶切鑒定

3.3 轉(zhuǎn)基因植物鑒定

對篩選到的陽性苗基因組進行PCR鑒定,PCR擴增條帶包括GFP及ACOS5部分片段,長度約為450bp,抗性平板共篩選到15株陽性苗,經(jīng)過PCR鑒定結(jié)果如下:

鑒定引物為:

F:CTATTTATATTCACTCTAGAG

R:GTACTCCAGCTTGTGCCCCA

圖4 轉(zhuǎn)基因植物PCR鑒定

3.4 熒光觀察

選取4號、6號轉(zhuǎn)基因植株進行傳代,在T3代通過抗性平板篩選分析,得到轉(zhuǎn)基因純合子.通過共聚焦顯微鏡對T3代轉(zhuǎn)基因植物進行觀察如圖四所示.同時對各個時期的熒光強度進行定量.結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因植物花藥從四期開始微弱表達GFP,并在八期時表達最高,隨后逐漸減弱,至十二期時最弱.

圖5 共聚焦顯微鏡分時期觀察結(jié)果

圖6 分時期熒光定量結(jié)果

4 討 論

花粉和花藥的發(fā)育一直是現(xiàn)代植物學(xué)研究的熱點,其過程復(fù)雜,涉及多個基因的表達及調(diào)控.隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,植物學(xué)的研究也不僅僅局限于分類、組織器官的顯微觀察、解剖觀察等方法,而是越來越多地運用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段對某些基因進行轉(zhuǎn)基因及表達模式分析,這些手段可以直接得到有力的生物學(xué)證據(jù),并極大地推動植物花藥發(fā)育的相關(guān)研究.以本研究為例,本報告系統(tǒng)可以直觀地對ACOS5的表達模式進行分析,如對不同時期花藥中ACOS5的表達觀察與分析,并進行量化分析.通過對ACOS5的表達模式進行分析,可以發(fā)現(xiàn)該基因在花藥發(fā)育第八期表達最強烈.據(jù)此推測，該基因發(fā)揮主要作用的時期為第七到第八期,相關(guān)資料顯示[1-2],該基因突變會導(dǎo)致雄性不育,那么,可能其主要影響花藥發(fā)育第七到第八期時的花藥結(jié)構(gòu),使絨氈層完整結(jié)構(gòu)不能建立[2-3],進而導(dǎo)致雄性不育.目前國內(nèi)外著名學(xué)者多數(shù)以原位雜交來研究基因的表達模式[3],原位雜交具有一些如實驗周期長、不能活體觀察、經(jīng)費開支大等缺點,而以GFP作為報告基因在操作上更方便,時間上更短,經(jīng)費上更經(jīng)濟,適合在擬南芥花藥研究中進行應(yīng)用.

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