上海銘源數(shù)康生物芯片有限公司(上海,201403)港龍生物技術(shù)(深圳)有限公司( 深圳， 518057)

人乳頭瘤病毒(HPV)是一類感染人類上皮細(xì)胞DNA病毒，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了130多種HPV型，有40多種可感生殖腔[1]。HPV可以引起人全身各部位的皮膚或者粘膜感染，導(dǎo)致多種上皮組織疾病，例如皮膚尋常疣，扁平疣，外生殖器的尖銳濕疣等。宮頸上皮組織長(zhǎng)期感染的某些型別的HPV可能引起基因突變，導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)增生(CIN)[2-3]和宮頸癌[4-5]。沒(méi)有HPV感染不可能導(dǎo)致宮頸癌，而有HPV感染不一定會(huì)導(dǎo)致疾病和宮頸癌。根據(jù)其導(dǎo)致宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)的高低將這些HPV分為高危型和低危型。高危型HPV可能引發(fā)婦女發(fā)生宮頸癌，主要包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、67、69、73、82等型別；低危型HPV主要引起尖銳濕疣，包括HPV6、11、40、42、43、44、54、55、57、61、71、81、83等型別。

以抗體捕獲、核酸雜交和化學(xué)發(fā)光信號(hào)放大技術(shù)為基礎(chǔ)的第二代雜交捕獲法(HCII，美國(guó)Qiagen公司產(chǎn)品)是最早獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)的臨床檢測(cè)HPV的方法[6]，能檢測(cè)13種高危型(包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68), 但是不具體分型。本研究采用的方法以PCR為基礎(chǔ)結(jié)合基因芯片(DNA微陣列)和反向點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)HPV進(jìn)行高通量分型檢測(cè)?；蛐酒巧镄酒囊粋€(gè)種類，以陣列方式設(shè)定在平面基質(zhì)載體上形成能夠并行處理生物樣本中多個(gè)基因信息的微處理單元，它具有微型化和并行處理的特征，點(diǎn)陣排布點(diǎn)直徑在500 μm以內(nèi)，相鄰兩個(gè)點(diǎn)的中心點(diǎn)間距在1 000 μm以內(nèi)，點(diǎn)陣列用于檢測(cè)基因分子。利用微量點(diǎn)樣技術(shù)，將29種HPV型特異性探針點(diǎn)樣于基因芯片基質(zhì)上，制成基因芯片；經(jīng)過(guò)對(duì)樣本中的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、雜交和顯色，檢測(cè)生殖道脫落細(xì)胞(如宮頸口、尿道口等部位脫落細(xì)胞)中的人乳頭瘤病毒(HPV)DNA，可分型檢測(cè)29種HPV型(包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、6、11、26、40、42、43、44、53、54、55、57、66、67、69、73、82)。適用于臨床HPV感染患者及可疑HPV感染人群輔助診斷。利用基因芯片技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)大樣本平行進(jìn)行高通量分析。本研究通過(guò)宮頸細(xì)胞樣本的檢測(cè)，與HCII試劑的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，對(duì)樣本感染HPV型別進(jìn)行序列分析驗(yàn)證，評(píng)價(jià)高通量人乳頭瘤病毒基因芯片的性能和臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 檢測(cè)試劑 人乳頭瘤病毒分型檢測(cè)試劑盒(基因芯片法)由港龍生物技術(shù)深圳有限公司提供，HCII HPV檢測(cè)試劑購(gòu)自Qiagen公司。

1.1.2 序列分析試劑 HotStar Taq Plus 購(gòu)自Qiagen 公司，按照設(shè)計(jì)的型別特異性PCR引物擴(kuò)增特定型別PCR產(chǎn)物，委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行序列分析服務(wù)。

1.1.3 儀器 ABI 9700 型PCR儀(Life Technologies)，人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)閱讀系統(tǒng)(港龍生物技術(shù)(深圳)有限公司)。

1.2 樣本處理和HPV檢測(cè)

宮頸脫落細(xì)胞樣本2 mL，均分為2份，其中一份樣本按照港龍生物技術(shù)(深圳)有限公司人乳頭瘤病毒核酸檢測(cè)試劑盒(基因芯片法)的方法進(jìn)行處理。取出待處理標(biāo)本，振蕩混勻；置離心機(jī)中以13 000 rpm離心5 min；棄上清，保留沉淀物。DNA提取時(shí)，準(zhǔn)備2個(gè)離心管，分別加入陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各5 μL。分別向上述對(duì)照品管及標(biāo)本管加入50 μL HPV DNA提取液，振蕩混勻；然后沸水浴(或干浴)10 min。將樣本管置離心機(jī)中，13 000 rpm離心10 min，保留上清液(DNA樣品)。 提取的DNA樣品3 μL直接加樣進(jìn)行PCR。另一份樣本按照HCII試劑的方法進(jìn)行處理和檢測(cè)。

1.3 HPV型特異性序列分析方法

在HPV 的L1區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物(序列見(jiàn)表1)，用特異性引物對(duì)29種HPV型別對(duì)相應(yīng)型別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用型特異性的正向或反向引物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析:對(duì)所有HPV分型檢測(cè)陽(yáng)性樣本，包括HPV分型和HCII都為高危型陽(yáng)性一致的樣本，用特異性引物擴(kuò)增，用其產(chǎn)物和特異性PCR引物測(cè)序；對(duì)于HCII陽(yáng)性，而HPV分型結(jié)果為陰性的樣本，分別用29種型別的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)產(chǎn)生的足夠PCR產(chǎn)物的樣本進(jìn)行序列分析。

特異性引物擴(kuò)增HPV DNA的反應(yīng)液20 μL體系的PCR反應(yīng)液組成為：1 PCR buffer Qiagen、0.4 mM 的dATP、dGTP、dCTP和dTTP(Takara)，正向引物和反向引物的濃度分別為2 pmol，0.1 μLHotStar Taq Plus (Qiagen), 樣本DNA加樣量為2 μL。特異性引物擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 5 min，94℃ 30 s、 56℃ 30 s、72℃ 30 s共45個(gè)循環(huán)，然后72℃ 延伸反應(yīng)5 min。HPV型特異性序列分析方法的靈敏度最低可以達(dá)到10拷貝/ L樣本。

表1 29種型別HPV L1區(qū)特異性擴(kuò)增引物序列Tab.1 The type-specific primers for PCR amplification of the segments in L1 gene among twenty-nine HPV genotypes

2 結(jié)果和討論

2.1 樣本的選擇

隨機(jī)選擇臨床門診生殖道HPV感染患者或可疑HPV感染病例，同時(shí)進(jìn)行高通量HPV分型檢測(cè)，并與HCII檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。本文試驗(yàn)包括來(lái)自三家醫(yī)院的500例樣本，其中包括156例HCII陽(yáng)性和344例HCII陰性。將HCII陽(yáng)性樣本設(shè)定為有病組，陰性樣本設(shè)定為無(wú)病組，假設(shè)本方法的靈敏度為95%、特異度為95%，在允許誤差δ為5%，顯著性水平α為0.05時(shí)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的最小樣本量分別為：

N有病組= (1.96)2×(0.95)×(1HPV0.95)/(0.05)2=72.99 ≈ 73

N無(wú)病組= (1.96)2×(0.95)×(1HPV0.95)/(0.05)2=72.99 ≈ 73

有病組現(xiàn)有156例，無(wú)病組344例，大于上述計(jì)算要求，樣本數(shù)符合具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的最小樣本量要求。

2.2 與HCII對(duì)比評(píng)價(jià)和分析

2.2.1與對(duì)比試劑的靈敏度和特異性評(píng)價(jià)

500例樣本比較高通量HPV分型檢測(cè)與HCII的檢測(cè)結(jié)果，其中高通量HPV分型檢測(cè)結(jié)果是指與HCII相同的13種高危型HPV檢測(cè)結(jié)果(即高危型HPV的陰陽(yáng)性判斷)，評(píng)價(jià)陽(yáng)性符合率、陰性符合率及總符合率(表2)。156例HCII陽(yáng)性樣本中，高通量HPV分型檢測(cè)陽(yáng)性143例、陰性13例；高通量HPV分型檢測(cè)的陽(yáng)性符合率為91.7%；344例HCII陰性樣本中，高通量HPV分型檢測(cè)結(jié)果有陰性329例、陽(yáng)性15例，高通量HPV分型檢測(cè)的陽(yáng)性符合率為90.5% (95%置信區(qū)間: 85.9% ～95.1%)、96.2% (95%置信區(qū)間: 94.2% ～98.2%)和94.4%(95%置信區(qū)間: 92.4% ～96.4%)，Kappa值為0.870(95%置信區(qū)間: 0.782～ 0.958)，說(shuō)明高通量HPV分型檢測(cè)與HCII一致性較好。

表2 高通量HPV分型檢測(cè)與HCII產(chǎn)品符合率評(píng)價(jià)Tab.2 Comparison between the high-throughput HPV genotyping assay (HPG) and HCII for the detection of High-risk HPV genotypes

* 與HCII試劑檢測(cè)范圍相同的13種高危型HPV檢測(cè)結(jié)果kappa=0.870(95%置信區(qū)間：0.782-0.958)

按照13種高危型HPV為標(biāo)準(zhǔn)判斷陰性和陽(yáng)性，與HCII檢測(cè)不一致的樣本共有28例(表2)。 在陽(yáng)性一致的樣本中，高通量HPV分型檢測(cè)方法可以得出型別結(jié)果和多型感染。對(duì)所有陽(yáng)性樣本和多型感染樣本進(jìn)行序列分析，以DNA序列分析結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)高通量HPV分型檢測(cè)方法的真實(shí)靈敏度和特異性，表3列出兩種方法不一致樣本的序列分析結(jié)果(HPV分型檢測(cè)至少有一種13種高危型的結(jié)果，與HCII結(jié)果一致，序列分析結(jié)果未列出)。

HCII與高通量HPV分型檢測(cè)結(jié)果不一致樣本中，包含HCII陽(yáng)性而高通量HPV分型檢測(cè)陰性13例，經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證，其中有6例樣本含有低危型HPV感染、同時(shí)序列分析未檢出13種高危型；有1例樣本對(duì)13種高危型進(jìn)行型特異性PCR及測(cè)序分析為陰性，說(shuō)明上述7例均為不含13種高危型HPV感染(HCII假陽(yáng)性)，有3例樣本經(jīng)測(cè)序分析確認(rèn)分別為HPV16、HPV58和HPV68感染，說(shuō)明HCII結(jié)果正確，高通量HPV分型檢測(cè)漏檢。另外，3例樣本DNA測(cè)序證實(shí)高通量HPV分型檢測(cè)分別未檢出HPV18、16、52高危型。以序列分析結(jié)果判斷，HCII陽(yáng)性樣本中有6例含有13種高危型HPV(真陽(yáng)性)，有7例不含13種高危型HPV(假陽(yáng)性)，造成假陽(yáng)性的樣本主要包含HPV66(3例)、HPV6(2例)和HPV53(1例)。

表3 HCII與高通量HPV分型檢測(cè)不一致樣本序列分析Tab.3 The sequences analysis of the discordant samples between HCII and HPG

注： 序列分析結(jié)果13種高危型HPV用黑體字表示

5例HCII陰性而高通量HPV分型檢測(cè)陽(yáng)性樣本中，10例樣本經(jīng)DNA測(cè)序分析證實(shí)其中分別含有相對(duì)應(yīng)高危型存在，說(shuō)明高通量HPV分型檢測(cè)結(jié)果正確，HCII漏檢(假陰性)；另有5例樣本高通量HPV分型檢測(cè)均檢出高危型，但測(cè)序未能確認(rèn)，判斷為高通量HPV分型檢測(cè)假陽(yáng)性。以序列分析結(jié)果判斷，這15例HCII樣本有5例為真陰性，10例為假陰性。

序列分析結(jié)果與高通量HPV分型檢測(cè)方法和HCII對(duì)13種高危型HPV的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比(表4)，以DNA測(cè)序分析結(jié)果判斷，500例樣本中，13種高危型陽(yáng)性樣本共有159例、13種高危型陰性341例。以序列分析結(jié)果評(píng)價(jià)兩種方法的靈敏度和特異性(表5)，高通量HPV分型檢測(cè)的靈敏度和特異度分別達(dá)到96.2%(95%置信區(qū)間：93.3%～99.2%)和98.5%(95%置信區(qū)間：97.3%～99.8%)，HCII的靈敏度和特異度分別為93.7%(95%置信區(qū)間：89.9%～97.5%)和97.4%(95%置信區(qū)間：96.4%～99.5%)，說(shuō)明高通量HPV分型檢測(cè)產(chǎn)品對(duì)13種高危型HPV DNA檢測(cè)的準(zhǔn)確性很高，高通量HPV分型檢測(cè)的靈敏度和特異度略高于HCII 。

表4 13種高危型的序列分析結(jié)果比較Tab.4 Comparison of the sequence analysis results with HPG and HCII

*與HCII試劑檢測(cè)范圍相同的13種高危型HPV檢測(cè)結(jié)果

表5 檢測(cè)的靈敏度和特異性比較Tab.5 Comparison of the sensitivity and specificity between HPG and HCII

注：括號(hào)內(nèi)數(shù)字表示95%置信區(qū)間

2.3 高通量HPV分型檢測(cè)分型準(zhǔn)確率評(píng)價(jià)

以DNA測(cè)序結(jié)果為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)本產(chǎn)品分型準(zhǔn)確率。比較高通量HPV分型檢測(cè)檢測(cè)陽(yáng)性樣本的測(cè)序結(jié)果，對(duì)測(cè)序確認(rèn)為多型感染的樣本，至少有2個(gè)型與高通量HPV分型檢測(cè)結(jié)果符合的判斷為分型準(zhǔn)確。如高通量HPV分型檢測(cè)多個(gè)型別，但是DNA測(cè)序驗(yàn)證僅證實(shí)其中某一型，則判斷為分型不準(zhǔn)確。如樣本DNA測(cè)序結(jié)果為陰性則不計(jì)入分型準(zhǔn)確率統(tǒng)計(jì)。

累計(jì)有197例樣本成功測(cè)序：其中分型準(zhǔn)確185例，包括138例單型感染和47例多重感染；分型不準(zhǔn)確樣本數(shù)為12例(表6)。以序列分析結(jié)果評(píng)價(jià)高通量HPV分析檢測(cè)方法的分型準(zhǔn)確率為93.9%(185/(197)。

表6 分型不準(zhǔn)確的樣本序列分析結(jié)果Tab.6 Comparison of the discordant samples between HPG and sequence analysis

注：(-)表示HPV陰性

2.4 HPV型別分布

根據(jù)DNA測(cè)序結(jié)果，29種HPV型在HPV陽(yáng)性樣本中的分布(表7)。高通量HPV分型檢測(cè)優(yōu)異的分析性能，能夠檢測(cè)29種型別，靈敏度高，分型的準(zhǔn)確率高，為HPV的臨床分型檢測(cè)提供了可靠的方法，同時(shí)它還具有檢測(cè)通量高，檢驗(yàn)成本低，操作方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，能夠極大的提高檢驗(yàn)工作效率，同時(shí)其對(duì)HPV的分型分析為疾病治療方案的選擇和HPV疫苗的研制都有很好的指導(dǎo)作用，適合臨床檢驗(yàn)工作的需要。

表7 29種型別在HPV陽(yáng)性樣本中出現(xiàn)的頻率分布(高至低排列)Tab.7 The distribution of HPV genotypes in the study population with HPV-positive

5HPV18145.4%6HPV39114.2%7HPV6114.2%8HPV5493.5%9HPV3183.1%10HPV5183.1%11HPV4483.1%12HPV3372.7%13HPV6872.7%14HPV3562.3%15HPV4362.3%16HPV1151.9%17HPV5351.9%18HPV6651.9%19HPV4541.5%20HPV5541.5%21HPV5931.1%22HPV4231.1%23HPV6731.1%24HPV4020.8%25HPV2610.4%26HPV5710.4%27HPV6910.4%28HPV7310.4%29HPV8210.4%

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