竇 薇，李 梅，韋 鴻，呂偉朋，李曉燕，呂 申

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 大連 116027)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

非小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞的E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)及病理意義

竇 薇，李 梅，韋 鴻，呂偉朋，李曉燕，呂 申

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 大連 116027)

目的了解非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)情況，并探討其病理意義。方法用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)143例NSCLC患者腫瘤細(xì)胞和44例患者癌旁支氣管黏膜上皮細(xì)胞的上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin和間葉標(biāo)志蛋白vimentin的表達(dá)情況，用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析上述蛋白表達(dá)與患者部分臨床病理參數(shù)關(guān)系。結(jié)果E-cadherin陽性表達(dá)率在肺癌細(xì)胞為52.4%，顯著低于癌旁支氣管黏膜上皮細(xì)胞的70.5%(P<0.05)，且癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)丟失與癌旁支氣管黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)丟失顯著正相關(guān)(r=0.539，P<0.05)；在低分化腺癌為34.4%，顯著低于高、中分化腺癌的61.7% (P<0.05)，在男性肺癌患者為43.2%，顯著低于女性患者的64.5%(P<0.05)，但其表達(dá)與患者的年齡、吸煙狀況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)類型無顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。Vimentin陽性表達(dá)率在肺癌細(xì)胞為36.4%，顯著高于癌旁支氣管上皮細(xì)胞的20.5%(P<0.05)，且癌細(xì)胞vimentin表達(dá)與癌旁支氣管黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)顯著正相關(guān)(r=0.814，P<0.05)；在低分化腺癌為62.5%，顯著高于高、中分化腺癌的30.0%(P<0.05)，但其表達(dá)與患者的性別、年齡、吸煙狀況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)類型無顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。E-cadherin與vimentin蛋白表達(dá)無顯著相關(guān)關(guān)系(r=0.108，P>0.05)。結(jié)論EMT現(xiàn)象存在于NSCLC，且在低分化腺癌表現(xiàn)尤為明顯。

非小細(xì)胞肺癌；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；E-cadherin；vimentin

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80%。NSCLC患者常死于腫瘤轉(zhuǎn)移，而腫瘤轉(zhuǎn)移與否則取決于多種因素。腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)就是其中之一。EMT是指具有上皮表型的癌細(xì)胞失去上皮分化向間葉表型轉(zhuǎn)變的過程。發(fā)生了EMT的腫瘤細(xì)胞常表現(xiàn)為極性消失、細(xì)胞-細(xì)胞間的粘附性降低以及侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[1]。近年來，分子靶向藥物表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)在臨床治療NSCLC中應(yīng)用廣泛，且療效顯著。該藥物的作用機(jī)制是抑制EGFR酪氨酸激酶磷酸化，阻止細(xì)胞EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動(dòng)，這不僅能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)也能抑制腫瘤的浸潤(rùn)，轉(zhuǎn)移等。然而，隨著該藥的臨床應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)多數(shù)NSCLC患者在接受治療伊始就對(duì)TKI不敏感，即原發(fā)耐藥；也有些患者在應(yīng)用TKI治療一段時(shí)間后出現(xiàn)了繼發(fā)性耐藥。有學(xué)者認(rèn)為，患者對(duì)EGFR-TKI不敏感可能與腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT有關(guān)[2]，即EMT現(xiàn)象的出現(xiàn)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞失去上皮分化特性，也就失去了TKI類藥物作用的靶點(diǎn)，從而逃避TKI的作用而能持續(xù)生長(zhǎng)，增殖。然而，EMT在NSCLC腫瘤轉(zhuǎn)移及引起EGFR-TKI耐藥的作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步探討。因此，如果對(duì) NSCLC用藥前EMT的狀態(tài)有所掌握，就能夠更深入地了解NSCLC腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制并且為NSCLC患者腫瘤分子靶向治療提供一些幫助。上皮鈣粘素(E-cadherin)是代表上皮的分子標(biāo)志物，目前認(rèn)為，E-cadherin表達(dá)缺失是EMT發(fā)生最重要的特征；波形蛋白(vimentin)是代表間葉的重要分子標(biāo)志物，其在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞向間葉表型轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志。本研究利用免疫組化的方法檢測(cè)E-cadherin和vimentin蛋白在NSCLC腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)狀況，并分析其與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材 料

收集2007—2009年大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一、第二醫(yī)院NSCLC標(biāo)本143例，其中，男性患者81例，女性患者62例; 年齡36～80歲，平均年齡(63.26±8.78)歲，其中60 歲及60歲以下患者66例，60 歲以上患者77例; 吸煙者52例，不吸煙者91例; 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移73例，未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移70例; 腺癌92例(其中高、中分化60例，低分化32例)，鱗癌47例(其中高、中分化26例，低分化21例); 腺鱗癌4例(其中高、中分化1例，低分化3例)。選擇其中44例癌旁支氣管黏膜上皮組織作為對(duì)照。

1.2 方 法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色：經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋的組織進(jìn)行4 μm連續(xù)切片。采用SP法染色，全部過程按試劑盒說明書完成。采用微波爐抗原修復(fù)，微波火力為P6，修復(fù)液沸騰后修復(fù)10 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。取已知陽性組織為陽性對(duì)照，以PBS 替代一抗為陰性對(duì)照。

1.2.2 判斷標(biāo)準(zhǔn): E-cadherin以癌細(xì)胞胞膜著色記為陽性；vimentin以癌細(xì)胞胞漿著色記為陽性。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)背景良好的高倍視野，依陽性細(xì)胞百分比和著色情況做半定量分析。陽性細(xì)胞百分比<25 %記為1 分、25 %～50 %記為2 分、51%～75 %記為3 分、> 75 %為4 分; 著色深淺：無色記為0 分、淡黃色記為1 分、棕黃色記為2 分、棕褐色記為3 分; 最后將二者相乘，積分<3 分為陰性，≥ 3 分為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Chi-square檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)分析，結(jié)果均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 E-cadherin和vimentin蛋白分別在肺癌細(xì)胞和癌旁支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況

E-cadherin蛋白陽性表達(dá)率在肺癌細(xì)胞中為52.4%，顯著低于癌旁支氣管上皮細(xì)胞的70.5%(P<0.05)；vimentin蛋白陽性表達(dá)率在肺癌細(xì)胞中為36.4%，顯著高于癌旁支氣管上皮細(xì)胞的20.5%(P<0.05)，見表1。E-cadherin蛋白在肺癌細(xì)胞陽性表達(dá)及陰性表達(dá)分別見圖1、2，vimentin蛋白在肺癌細(xì)胞陽性表達(dá)及陰性表達(dá)分別見圖3、4。

表1 E-cadherin和vimentin蛋白分別在肺癌細(xì)胞和癌旁支氣管上皮細(xì)胞中的陽性表達(dá)

2.2 E-cadherin和vimentin蛋白在肺癌細(xì)胞和相應(yīng)癌旁支氣管上皮細(xì)胞中表達(dá)的相關(guān)性

E-cadherin和Vimentin蛋白在44例肺癌細(xì)胞和相應(yīng)癌旁支氣管上皮細(xì)胞的表達(dá)均呈顯著正相關(guān)(r=0.539，P<0.05；r=0.814，P<0.05)，見表2。

表2 E-cadherin和vimentin蛋白在44例肺癌細(xì)胞與相應(yīng)支氣管上皮細(xì)胞中表達(dá)的相關(guān)性

圖1 E-cadherin蛋白陽性表達(dá)(SP×400)

圖3 Vimentin蛋白陽性表達(dá)(SP×400)

圖2 E-cadherin蛋白陰性表達(dá)(SP×400)

圖4 Vimentin蛋白陰性表達(dá)(SP×400)

2.3 E-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

E-cadherin蛋白陽性表達(dá)率在男性患者為43.2%，顯著低于女性患者的64.5%(P<0.05)，在低分化腺癌為61.7%，顯著低于高、中分化腺癌的34.4%(P<0.05)，但其表達(dá)與患者的年齡、吸煙狀況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)類型無明顯關(guān)系(P>0.05)；Vimentin蛋白表達(dá)陽性率在低分化腺癌為62.5%，顯著高于高、中分化的腺癌30.0%(P<0.05)，但其表達(dá)與患者的性別、年齡、吸煙狀況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)類型無明顯關(guān)系(P>0.05)，見表3。

表3 E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

1) 腺癌與鱗癌的比較；2) 鱗癌與腺鱗癌的比較；3) 腺癌與腺鱗癌的比較

2.4 肺癌組織中E-cadherin與vimentin蛋白表達(dá)的相關(guān)性

在143例NSCLC組織中，E-cadherin和vimentin蛋白同時(shí)陽性表達(dá)共有31例，同時(shí)陰性共有47例，E-cadherin蛋白表達(dá)陽性、vimentin蛋白表達(dá)陰性共有44例，E-cadherin蛋白表達(dá)陰性、vimentin蛋白表達(dá)陽性共有21例。通過spearman相關(guān)分析，E-cadherin和vimentin蛋白在NSCLC中的表達(dá)無顯著相關(guān)關(guān)系(r=0.108，P>0.05)。

3 討 論

E-cadherin是一類介導(dǎo)細(xì)胞間粘附的跨膜糖蛋白，存在于細(xì)胞表面，人類E-cadherin編碼基因定位于16號(hào)染色體q22.1，由723～748個(gè)氨基酸組成，包括N-端胞外區(qū)、高度疏水跨膜區(qū)及C-端胞內(nèi)區(qū)。E-cadherin的主要功能是維持上皮細(xì)胞之間的粘附性，保持上皮表型。E-cadherin表達(dá)減少或缺失時(shí)，由E-cadherin介導(dǎo)的粘附功能受損，腫瘤細(xì)胞連接松散，容易脫離原發(fā)灶而發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此E-cadherin蛋白表達(dá)減少或缺失被認(rèn)為是發(fā)生EMT的標(biāo)志。大量研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌、膀胱癌、乳腺癌以及NSCLC在內(nèi)的多種來源于上皮的腫瘤常會(huì)出現(xiàn)E-cadherin蛋白表達(dá)減少或缺失的病例[3]。Vimentin是一類中間纖維蛋白，人類vimentin的編碼基因定位于10號(hào)染色體p13，由464個(gè)氨基酸組成。Vimentin蛋白在正常上皮細(xì)胞中無表達(dá)，但在內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等間充質(zhì)來源的細(xì)胞中廣泛存在。有文獻(xiàn)報(bào)道，在膀胱癌和乳腺癌中，vimentin蛋白高表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且可以做為腫瘤預(yù)后不良的標(biāo)志[4-5]。

本研究中，E-cadherin蛋白在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于癌旁支氣管黏膜上皮細(xì)胞，且在同一病例癌細(xì)胞與癌旁支氣管黏膜上皮細(xì)胞中表達(dá)呈顯著正相關(guān)；vimentin蛋白在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于癌旁支氣管黏膜上皮細(xì)胞，且在同一病例癌細(xì)胞與癌旁支氣管黏膜上皮細(xì)胞中表達(dá)呈顯著正相關(guān)提示在NSCLC中存在EMT現(xiàn)象。

Liu等[6]研究顯示，E-cadherin蛋白在NSCLC中的表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況和預(yù)后有關(guān)。S Al-Saad等[7]研究發(fā)現(xiàn)，vimentin蛋白的表達(dá)強(qiáng)度隨NSCLC分化程度降低而逐漸增高。本研究發(fā)現(xiàn)在組織學(xué)類型為肺腺癌的腫瘤細(xì)胞中E-cadherin、vimentin蛋白的表達(dá)與腫瘤分化程度有顯著相關(guān)關(guān)系，即E-cadherin蛋白在高中分化的腺癌的表達(dá)顯著高于低分化腺癌，vimentin蛋白在高、中分化腺癌的表達(dá)顯著低于低分化腺癌，這一方面提示檢測(cè)E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)狀況對(duì)判定肺腺癌患者的惡性程度有一定意義，可以做為肺腺癌患者預(yù)測(cè)惡性程度的重要指標(biāo)。另一方面也提示低分化腺癌更容易出現(xiàn)TKI耐藥現(xiàn)象，這可能是由于低分化腺癌腫瘤細(xì)胞E-cadherin蛋白低表達(dá)及vimentin蛋白高表達(dá)而出現(xiàn)EMT現(xiàn)象，這會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞因失去EGFR-TKI作為位點(diǎn)而不斷生長(zhǎng)，增殖。另外，本研究沒有發(fā)現(xiàn)E-cadherin、vimentin的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況有明顯關(guān)系，這說明EMT的發(fā)生可能只是引起轉(zhuǎn)移的原因之一，并不是所有的腫瘤轉(zhuǎn)移都與EMT的發(fā)生有關(guān)。

眾所周知，女性、亞裔、不吸煙的腺癌患者對(duì)EGFR-TKI治療敏感。有研究報(bào)道，存在EGFR突變和E-cadherin陽性表達(dá)的NSCLC的患者可從分子靶向藥EGFR-TKI中受益[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin蛋白在女性患者腫瘤細(xì)胞的表達(dá)顯著高于男性患者。以上研究提示E-cadherin蛋白陽性表達(dá)的肺腺癌女性患者可能會(huì)對(duì)EGFR-TKI敏感。本研究中未發(fā)現(xiàn)E-cadherin和vimentin的表達(dá)有相關(guān)性，這可能是兩種蛋白在EMT發(fā)生過程中的表達(dá)異常是兩個(gè)相互獨(dú)立的因素。

綜上所述，NSCLC發(fā)生的過程中存在EMT現(xiàn)象，并且E-cadherin蛋白有望成為預(yù)測(cè)NSCLC患者對(duì)分子靶向藥物EGFR-TKI治療敏感性的重要生物學(xué)分子標(biāo)志物。

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ClinicalsignificanceofE-cadherinandvimentinproteinexpressionsinthetumorcellsofnon-smallcelllungcancer

DOUWei，LIMei，WEIHong，LVWei-peng，LIXiao-yan，LVShen

(LaboratoryCenter,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China)

ObjectiveTo understand the situation of epithelial-mesenchymal transitions (EMT) in non-small cell lung cancer (NSCLC) and investigate the pathological and clinical significance of it.MethodsThe immunohistochemistry was used to detect protein expressions of E-cadherin and vimentin in 143 samples of NSCLC and 44 samples of bronchus epithelial cells surrounding tumor. The SPSS17.0 statistic software was used to analyze the correlation between the protein expressions and the clinic-pathological agents of the patients with NSCLC.ResultsThe positive expression rate of E-cadherin protein in the tumor cells of NSCLC was statistically lower than that in bronchus epithelial cells surrounding tumor (52.4% vs.70.5%,P<0.05), and there was significant correlation between tumor cells and their corresponding bronchus epithelial cells surrounding tumor (r=0.539,P<0.05). Furthermore, the rate in the poorly differentiated adenocarcinoma(34.4%)was statistically lower than that in the well-moderately differentiated adenocarcinoma(61.7%) (P<0.05), and the rate in the male patients(43.2%) was statistically lower than that in the female (64.5%)(P<0.05). However，the expression was not significantly related to patients’ age, smoking status, tumor histological type and lymph node metastasis(P>0.05). The positive expression rate of vimentin protein in the tumor cells of NSCLC was statistically higher than that in bronchus epithelial cells surrounding tumor (36.4% vs 20.5%,P<0.05), and there was significant correlation between tumor cells and their corresponding bronchus epithelial cells surrounding tumor(r=0.814,P<0.05). The rate in the poorly differentiated adenocarcinoma(62.5%) was statistically higher than that in the well-moderately differentiated adenocarcinoma(30.0%)(P<0.05). The expression was not significantly related to patients’ gender, age, smoking status, tumor histological type and lymph node metastasis(P>0.05).The expression of E-cadherin protein was not related to that of vimentin (r=0.108,P>0.05).ConclusionEMT phenomenon occurs in NSCLC, panticalarly in the poorly differentiated adenocarcinoma.

NSCLC; EMT; E-cadherin; vimentin

10.11724/jdmu.2013.04.02

R734.2

A

1671-7295(2013)04-0311-05

竇薇，李梅，韋鴻，等.非小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞的E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)及病理意義[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,35(4)：311-315.

國(guó)家自然科學(xué)基金(81071805)

竇 薇(1985-)，女，黑龍江大慶人，碩士研究生。E-mail:douwei315@yahoo.cn

呂 申，教授。E-mail:lvshen1956@yahoo.com.cn

2013-01-30；

2013-05-07)