李時光 陳江波 李 靜

1）鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科五病區(qū) 鄭州 450000 2）新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院神內(nèi)一科 新鄉(xiāng) 453000

急性一氧化碳（CO）中毒可造成以中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)功能損害為主的全身各組織細胞的損傷［1］。部分急性一氧化碳（CO）中毒患者經(jīng)治療神志清醒后，經(jīng)過3～60d表現(xiàn)正?；蚪咏５募儆?，會出現(xiàn)急性一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦?。―EACMP），出現(xiàn)以癡呆、精神失常和錐體外系癥狀為主要表現(xiàn)的一組神經(jīng)精神癥狀。

目前，甄龍等［2-3］研究發(fā)現(xiàn)，血清水平免疫因子參與DEACMP的發(fā)病，證實DEACMP可能是由于急性一氧化碳中毒誘發(fā)腦神經(jīng)免疫損傷所致。但年齡、性別類似且中毒程度相同的患者發(fā)生幾率又有很大差別，提示存在個體間的差異，推測個體遺傳因素可能起到了重要作用。

DEACMP 的病理改變-腦白質廣泛的脫髓鞘及腦萎縮特點［4］均與多發(fā)性硬化（MS）類似，兩者同屬于獲得性中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，在腦部病理損傷中有著許多共同之處。目前DEACMP 的基因研究未見相關報道，關于MS易感基因多態(tài)性研究多集中在免疫相關基因、髓鞘結構基因等方面。本實驗通過MS全基因組關聯(lián)研究等相關文獻［5-6］的檢索和比較，選用TNF-α基因308位點，研究其基因多態(tài)性與DEACMP的遺傳易感性之間的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 DEACMP組109例，男55例，女54例；年齡42～89 歲，平均（59.68±9.72）歲。文化程度：文盲32例，小學41例，中學以上36例。急性CO 中毒時均有昏迷史，昏迷持續(xù)時間2～72h，平均（16.09±15.13）h。間歇期（急性一氧化碳中毒昏迷清醒后到出現(xiàn)遲發(fā)腦病癥狀之間的時間間隔）7～45d，平均（20.27±9.43）d。急性CO 中毒組115例，男50 例，女65 例；年齡40～84 歲，平 均（56.12±7.38）歲。文化程度：文盲34 例，小學39 例，中學以上42例。急性CO 中毒時均有昏迷史，昏迷持續(xù)時間1～51h，平均（6.78±7.49）h。對所有患者均進行90d以上的隨訪，均未發(fā)生DEACMP。2組均為豫北地區(qū)漢族患者，均取得患者或其家屬知情同意。2組間年齡、性別及文化程度均組間匹配。

1.2 方法

1.2.1 標本采 集：DEACMP 組 患 者 均 于 晨6～8 時，急 性CO 中毒組患者于搶救成功完全清醒后2h內(nèi)，采集空腹肘靜脈5mL EDTA 抗凝血，置于-70℃低溫冰箱中保存。應用TIANGEN 公司血液基因組DNA 提取試劑盒提取DNA。

1.2.2 檢 測 方 法：TNF-α308 基 因 多 態(tài) 性分 析：參 照 呂 兆琴［7］、Tarkowski等［8］的實驗方法，設計擴增TNF-α308啟動子區(qū)域的上游引物序列為TNF1 5′-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCATG-3′和 下 游 引 物 序 列 為TNF2 5′-ACACACAAGCATCAAGGATACC-3′（由大連TaKaRa生物工程有限公司合成）。擴增片段長度為143bp。PCR 體系總體積為25μL，其中包括EmeraldAmpTM PCR Master Mix（PCR 反應用各種酶、Buffer、dNTP混合物等試劑的2倍濃度預混型制品）12.5μL、DNA 模板5μL、上游和下游引物（10μmol／L）各1μL、滅菌蒸餾水（dH2O）5.5μL。擴增程序為：①95℃預變性5min；②熱循環(huán)：95℃30s，58.8℃50s，72℃90 s，共30個循環(huán)；③延伸：72℃5min。酶切體系總體積為10 μL，含有：3μl PCR 擴 增 產(chǎn) 物，內(nèi) 切 酶StyI（10μg／μL）0.5 μL，RE 10× Buffer 1μL，Acetylated BSA（10μg／μL）0.1 μL，滅菌雙蒸水5.4μL。體系充分混勻后在37℃恒溫水浴1.5h，72℃水浴10min終止消化。2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，BTS-20 M 型凝膠成像分析系統(tǒng)攝像并保存。

1.3 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0軟件包進行數(shù)據(jù)處理?；蛐头植碱l率的Hardy-Weinberg平衡檢驗采用擬合優(yōu)度卡方檢驗。TNF-α308 基因型、等位基因計數(shù)用直接計數(shù)法，并計算基因型及等位基因頻率，組間比較采用χ2檢驗。

表1 2組各基因型Hardy-Weinberg平衡檢驗

表2 2組各基因型分布和等位基因頻率的比較 ［n（%）］

表3 2組女性患者各基因型分布和等位基因頻率的比較 ［n（%）］

表4 2組男性患者各基因型分布和等位基因頻率的比較 ［n（%）］

2 結果

從表1可以看出2組各基因型Hardy-Weinberg平衡檢驗，差異沒有統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05），說明2組樣本有群體代表性。2組間TNF-α308基因型分布及等位基因頻率的比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05）。（見表2）。按性別分層后，2組間TNF-α308各基因型和等位基因頻率比較（見表3、表4）。差異仍無統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05）。

3 討論

人TNF基因位于6 號染色體主要組織相容性復合體（MHC）區(qū)內(nèi)的7kb區(qū)，其編碼產(chǎn)物是具有廣泛生物學活性的多態(tài)調(diào)節(jié)因子TNF-α和TNF-β。研究發(fā)現(xiàn)TNF 基因多態(tài)性現(xiàn)象的標志是其基因內(nèi)的堿基變化，TNF-α基因的多態(tài)性位點主要集中在其啟動子區(qū)域，此區(qū)域多個位點具有多態(tài)性。Kroeger與Gonzalez等［9-10］對TNF-α308位點G／A 多態(tài)性對TNF-α轉錄的影響進行了研究，發(fā)現(xiàn)G 等位基因突變?yōu)锳 后，TNF-α基因轉錄效率明顯增加，提示TNF-α308位點A 等位基因可能通過促進TNF-α基因轉錄，提高血中TNF-α含量，從而影響對疾病的易感性。國內(nèi)蒲杰［11］、Lu［12］等研究也發(fā)現(xiàn)TNF-α308基 因 型（包 括GA 和AA 型）可以提高TNF-α啟動子的轉錄活性而增加TNF-α的轉錄合成，促進炎癥反應的發(fā)生。

本實驗研究了啟動子區(qū)域TNF-α308 位點基因型頻率及等位基因頻率在豫北漢族DEACMP組和急性CO 中毒組（對照組）患者中的分布，2組比較差異無統(tǒng)計學意義。按性別分層后，差異無統(tǒng)計學意義。

盡管在DEACMP發(fā)病過程中存在免疫介質TNF-α表達異常，但本實驗未發(fā)現(xiàn)TNF-α308基因多態(tài)性與DEACMP關聯(lián)，考慮原因如下：（1）樣本大小和種族差異的問題，由于TNF-α308A 等位基因在漢族人群中分布較少，樣本量過少會導致GA、AA 基因型頻度顯著下降，導致統(tǒng)計結果無差異性；（2）TNF 基因位于HLA-Ⅲ類基因區(qū)內(nèi)，與某些HLA 單倍型存在鏈鎖不平衡，而這些單倍型亦可能與TNF 基因轉錄調(diào)節(jié)有關，并且可能起主導作用，而TNF 基因起輔助或協(xié)同作用。

總之，本實驗結果雖未發(fā)現(xiàn)TNF-α308 基因多態(tài)性與DEACMP遺傳易感性之間存在關聯(lián)，但擴大樣本量，進行更深入的研究，有望獲得更有價值的發(fā)現(xiàn)。

［1］葉任高，陸再英.內(nèi)科學［M］.6版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：971-974.

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