楊敬敏，黃蘇珍，楊永恒

〔江蘇省·中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)，江蘇南京210014〕

甜菊(Stevia rebaudiana Bertoni)又名甜葉菊，隸屬于菊科(Asteraceae)甜菊屬(Stevia Cav.)，為多年生草本植物，原產(chǎn)南美洲巴拉圭與巴西交界的阿曼拜山脈，當(dāng)?shù)卦∶窈茉缇蛯⑻鹁兆鳛樘橇鲜褂?。從甜菊中獲得的甜味提取物甜菊糖苷的甜度約為蔗糖的300倍，不但甜度高，還具有熱量低、口感好、穩(wěn)定性強的特點，對高血壓、糖尿病和兒童齲齒也有預(yù)防和輔助治療作用，目前被譽為“最佳天然甜味劑”［1－2］。甜菊自20世紀(jì)70年代中期引入中國后被廣泛引種和推廣栽培，目前中國已成為全世界最大的甜菊種植國及甜菊糖苷的生產(chǎn)和出口國。甜菊優(yōu)良品種選育與優(yōu)質(zhì)甜菊糖苷的生產(chǎn)密切相關(guān)，因此選育具有甜菊糖苷含量高、高產(chǎn)并具有優(yōu)良抗性的新品種是甜菊育種的主要目標(biāo)［3－4］。

目前，常規(guī)育種方法是雜交育種，它可以將2個親本的不同優(yōu)良性狀集中于同一后代，但受選育周期較長和自然變異率較低等因素限制［5－6］。輻射誘變因其變異率較高和較易獲得變異材料等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于作物育種［7－9］。甜菊種子十分細小且表皮極薄，對γ射線和離子的阻擋作用較低，使γ射線和離子很易直接作用于種胚DNA，低劑量的射線和離子注入即可產(chǎn)生顯著的影響，因而適宜進行γ射線和離子注入誘變［10］。諸多研究結(jié)果均表明利用輻射誘變進行甜菊育種是有效的［10－16］。沈明山等［12］的研究結(jié)果表明:注入碳離子的甜菊種子的萌發(fā)率和株高均高于對照組。舒世珍等［15－16］認為:使用一定劑量的氮離子束輻射處理甜菊種子，不僅可以促進幼苗根及葉的生長、提高產(chǎn)量，同時還可以提高糖苷含量以及萊鮑迪苷A的含量。

作者以甜菊5個雜交組合F1代種子［17］為實驗材料，選用60Co－γ和離子束為輻射源進行輻照，對種子萌發(fā)率和幼苗成活率進行比較，同時對實生單株的生長和形態(tài)指標(biāo)進行觀測與分析，以期篩選出兼具抗寒和優(yōu)良農(nóng)藝性狀的甜菊優(yōu)良單株，并為甜菊誘變育種的進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為甜菊人工雜交種子，于2010年8月至11月通過人工雜交獲得。雜交組合及其種子數(shù)量分別為:組合Ⅰ‘守田2號’ב中山3號’(‘Shoutian No.2’בZhongshan No.3’)F1代種子 292 粒;組合Ⅱ‘守田 2號’ב中山 4號’(‘Shoutian No.2’בZhongshan No.4’)F1代種子271粒;組合Ⅲ‘中山3號’ב守田2號’(‘Zhongshan No.3’בShoutian No.2’)F1代種子149粒;組合Ⅳ‘中山3號’ב守田3號’(‘Zhongshan No.3’בShoutian No.3’)F1代種子220粒;組合Ⅴ‘守田3號’自交(‘Shoutian No.3’בShoutian No.3’)F1代種子346粒，共計1 278粒種子。

雜交親本品種‘中山3號’、‘中山4號’、‘守田2號’和‘守田3號’均來源于江蘇省·中國科學(xué)院植物研究所，其中，‘中山3號’為總苷高含量品種，‘中山4號’為萊鮑迪苷A高含量兼較高產(chǎn)品種，‘守田2號’為高產(chǎn)品種，‘守田3號’為萊鮑迪苷A高含量品種［18］。

1.2 方法

1.2.1 誘變處理 誘變輻射源分別為60Co－γ和離子束。將各雜交組合種子平均分成3組，分別為對照、60Co－γ 注入(劑量15 Gy，劑量率0.5 Gy·min－1)和離子束注入(能量 20 keV，劑量 2.6×1016N+·cm－2)處理組。60Co－γ注入在安徽雙豐農(nóng)業(yè)高新技術(shù)有限責(zé)任公司進行，離子束注入在中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院進行，對照組種子不進行任何處理。

1.2.2 播種和育苗 于2011年4月上旬至5月下旬進行播種和育苗。將對照及輻射處理后的種子按照不同的雜交組合和處理分別播種于育苗盤(長和寬均為40.0 cm、高4.5 cm)中，栽培基質(zhì)為V(細沙)∶V(園土)∶V(泥炭)=1∶1∶2 的混合基質(zhì)。播種前輕輕揉搓去掉冠毛，分小區(qū)均勻播在基質(zhì)上，輕輕覆1層薄土。播種后保持基質(zhì)濕潤，自然光照。每天觀察種子的發(fā)芽情況，記錄各處理各雜交組合種子的發(fā)芽數(shù)并計算發(fā)芽率。待實生苗長至5～6對真葉時移栽至大田中，統(tǒng)計不同處理各雜交組合幼苗的存活數(shù)并計算存活率。

1.2.3 植株形態(tài)學(xué)性狀觀測 對定植在田間的5個雜交組合后代的所有實生植株的形態(tài)性狀(包括株高、葉寬、葉長、莖粗、分枝數(shù)、節(jié)數(shù)和平均節(jié)間長度)進行觀測，觀測時期為初蕾期，即植株最早出現(xiàn)花蕾的時期。株高為從地面到植株頂端的高度;葉寬為植株中部最寬葉片的寬度;葉長為植株中部最長葉片葉基至葉尖的長度;莖粗為距地面5 cm處主莖的直徑;分枝數(shù)為著生于主莖10 cm以上的一級分枝數(shù);節(jié)數(shù)為主莖上第1節(jié)至頂芽間的節(jié)數(shù);以株高除以主莖的節(jié)數(shù)計算平均節(jié)間長度。其中，株高用卷尺測量，葉寬和葉長用直尺測量，莖粗用游標(biāo)卡尺測量;每個指標(biāo)重復(fù)測量3次，取平均值。

在植株越冬休眠前統(tǒng)計從植株基部萌發(fā)的腳芽數(shù)量，以此評價雜交組合后代植株的耐寒性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

按以下公式計算種子發(fā)芽率和幼苗成活率［19－20］:種子發(fā)芽率=(發(fā)芽種子數(shù)/播種種子數(shù))×100%;幼苗成活率=(成活幼苗數(shù)/發(fā)芽種子數(shù))×100%。采用Excel 2010和SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析以及變異系數(shù)［21］計算。

2 結(jié)果和分析

2.1 60Co－γ和離子束注入對甜菊不同雜交組合后代種子發(fā)芽率和幼苗成活率的影響

經(jīng)60Co－γ和離子束注入處理后甜菊不同雜交組合F1代種子的發(fā)芽率和幼苗的成活率見表1。由表1可以看出:與對照相比，經(jīng)60Co－γ注入后的雜交組合‘中山3號’ב守田2號’后代種子和經(jīng)離子束注入后的雜交組合‘守田2號’ב中山3號’后代種子的發(fā)芽率顯著高于對照組，經(jīng)60Co－γ和離子束注入后的其他雜交組合后代種子的發(fā)芽率均顯著低于對照組。從幼苗成活率看，經(jīng)60Co－γ注入后雜交組合‘守田2號’ב中山3號’和‘守田2號’ב中山4號’以及經(jīng)離子束注入后的雜交組合‘中山3號’ב守田2號’及‘中山3號’ב守田3號’后代幼苗的成活率均顯著高于對照，而在這2種輻照條件下其他雜交組合后代幼苗的成活率均顯著低于對照。說明使用合適的輻射源對于提高甜菊雜交組合后代的種子發(fā)芽率和幼苗成活率有一定作用。

表1 60Co－γ和離子束注入對甜菊不同雜交組合F1代種子發(fā)芽率和幼苗成活率的影響1)Table 1 Effects of60Co-γ and ion beam injections on F1seed germination and seedling survival rate of different cross combinations of Stevia rebaudiana Bertoni1)

從5個雜交組合后代種子發(fā)芽率和幼苗成活率的平均值來看，這2種輻照方式均對甜菊雜交后代種子萌發(fā)有一定影響，60Co－γ和離子束注入后種子發(fā)芽率的平均值均顯著低于對照，其中離子束注入后種子發(fā)芽率的平均值降幅更大;60Co－γ注入后5個雜交組合后代幼苗成活率的平均值均顯著高于對照，而離子束注入后幼苗成活率的平均值均顯著低于對照。此外，由表1還可見:60Co－γ和離子束注入后各雜交組合后代種子發(fā)芽率和幼苗成活率的變異系數(shù)均顯著大于對照。

上述研究結(jié)果說明:60Co－γ和離子束注入對甜菊的種子發(fā)芽率和幼苗成活率產(chǎn)生了顯著的誘導(dǎo)效應(yīng)，對部分雜交組合后代種子發(fā)芽率和幼苗成活率的提高有一定的作用。

2.2 60Co－γ和離子束注入對甜菊不同雜交組合后代幼苗植株形態(tài)性狀的影響

2.2.1 對莖部形態(tài)性狀的影響 經(jīng)60Co－γ和離子束注入處理后甜菊不同雜交組合后代植株莖部形態(tài)性狀的變化見表2。

從株高看，僅離子束注入后的‘守田2號’ב中山3號’雜交組合后代和‘守田3號’自交后代幼苗的株高與對照組間差異不顯著，其他處理組各雜交組合后代幼苗的株高均顯著低于對照組，說明60Co－γ和離子束注入這2種輻射處理方式均有助于甜菊雜交后代植株的矮化。

從節(jié)數(shù)看，經(jīng)60Co－γ注入后5個雜交組合后代幼苗的節(jié)數(shù)均顯著低于對照組;而離子束注入后，僅‘中山3號’ב守田3號’雜交后代幼苗的節(jié)數(shù)顯著低于對照組，其他雜交組合后代幼苗的節(jié)數(shù)與對照組間均無顯著差異。說明60Co－γ注入對甜菊植株節(jié)數(shù)的誘變效果較為顯著。

表2 60Co－γ和離子束注入對甜菊不同雜交組合后代幼苗莖部形態(tài)性狀的影響(±SE)1)Table 2 Effects of60Co-γ and ion beam injections on stem morphological character of progeny seedlings of different cross combinations of Stevia rebaudiana Bertoni(±SE)1)

表2 60Co－γ和離子束注入對甜菊不同雜交組合后代幼苗莖部形態(tài)性狀的影響(±SE)1)Table 2 Effects of60Co-γ and ion beam injections on stem morphological character of progeny seedlings of different cross combinations of Stevia rebaudiana Bertoni(±SE)1)

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)Different small letters in the same column indicate the significant difference(P＜0.05).2)Ⅰ:‘守田2號’ב中山3 號’‘Shoutian No.2’בZhongshan No.3’;Ⅱ:‘守田2 號’ב中山4 號’‘Shoutian No.2’בZhongshan No.4’;Ⅲ:‘中山3號’ב守田2號’‘Zhongshan No.3’בShoutian No.2’;Ⅳ:‘中山3 號’ב守田3號’‘Zhongshan No.3’בShoutian No.3’;Ⅴ:‘守田3 號’ב守田3 號’‘Shoutian No.3’בShoutian No.3’.

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從平均節(jié)間長度看，除‘中山3號’ב守田3號’和‘守田3號’ב守田3號’雜交組合外，經(jīng)60Co－γ和離子束注入后其他雜交組合后代幼苗的平均節(jié)間長度均顯著低于對照組。說明60Co－γ和離子束注入均可誘導(dǎo)甜菊植株節(jié)間長度縮短，有利于株型緊湊型后代的誘導(dǎo)。

從分枝數(shù)看，經(jīng)60Co－γ和離子束注入后‘守田3號’自交后代幼苗的分枝數(shù)較對照組有所增加;而經(jīng)60Co－γ和離子束注入后其他雜交組合后代幼苗的分枝數(shù)則均較對照組有所降低。說明2種輻射源處理均能誘導(dǎo)‘守田3號’自交后代幼苗分枝數(shù)的增加，有利于篩選高產(chǎn)后代單株;而對于其他雜交組合，這2種輻射源處理均能誘導(dǎo)后代幼苗分枝數(shù)的減少，有利于抗倒伏后代單株的篩選。

從莖粗看，經(jīng)過60Co－γ和離子束注入處理后，‘中山3號’ב守田2號’雜交后代植株的莖粗顯著增加，‘守田2號’ב中山4號’和‘中山3號’ב守田3號’雜交組合后代及‘守田3號’自交后代植株的莖粗均較對照組顯著降低;經(jīng)60Co－γ注入處理后‘守田2號’ב中山3號’雜交組合后代植株的莖粗顯著小于對照組，而經(jīng)離子束注入后其后代植株的莖粗與對照組無顯著差異。說明60Co－γ和離子束注入這2種輻照方式對甜菊不同雜交后代植株莖粗的誘變效應(yīng)有差異，選擇合適的雜交組合進行誘變有可能得到莖粗增加的變異后代。

從5個雜交組合后代莖部形態(tài)性狀5個指標(biāo)的平均值來看，經(jīng)60Co－γ和離子束注入后，植株的株高、節(jié)數(shù)、分枝數(shù)、平均節(jié)間長度及莖粗均顯著低于對照，而且60Co－γ處理組5個指標(biāo)的平均值均顯著低于離子束處理組。說明60Co－γ和離子束注入均對植株莖部上述各指標(biāo)有顯著誘變作用，而且60Co－γ注入的誘變作用較離子束注入更顯著。因此，采用這2種輻射源處理均有助于選育分枝較少、節(jié)間較短的株型緊湊型甜菊植株后代。

經(jīng)60Co－γ注入后各雜交組合后代植株的株高、節(jié)數(shù)及分枝數(shù)的變異系數(shù)均顯著高于對照組，說明經(jīng)60Co－γ注入后各雜交組合后代植株的這3個莖部指標(biāo)的變異譜增加，從不同雜交組合后代中篩選出植株高、節(jié)間短和分枝多等性狀植株的概率增加，從而有利于獲得高產(chǎn)后代單株。經(jīng)離子束注入后各雜交組合后代植株的株高和平均節(jié)間長度的變異系數(shù)顯著低于對照，分枝數(shù)則顯著高于對照組，而節(jié)數(shù)的變異系數(shù)與對照差異不顯著，表明離子束注入有利于矮生、株型緊湊且分枝多的后代單株的選育。經(jīng)離子束注入后各雜交組合后代植株莖粗的變異系數(shù)顯著低于對照，但經(jīng)60Co－γ注入后莖粗的變異系數(shù)顯著高于對照，說明通過60Co－γ誘變可篩選得到相對抗倒伏的后代單株。

2.2.2 對葉部形態(tài)性狀的影響 經(jīng)60Co－γ和離子束注入處理后甜菊不同雜交組合后代植株葉部性狀的變化見表3。

由表3可以看出:經(jīng)60Co－γ和離子束注入后，‘守田2號’ב中山3號’雜交后代的葉寬及葉寬/葉長比均顯著低于對照組，‘守田2號’ב中山4號’雜交后代的葉寬、葉長及葉寬/葉長比均顯著低于對照組;經(jīng)離子束注入后‘守田3號’自交后代的葉寬及葉寬/葉長比也顯著低于對照組;而經(jīng)60Co－γ和離子束這2種輻射源處理后其他雜交組合后代的3個指標(biāo)與對照組均無顯著差異。

從葉部3個性狀指標(biāo)的平均值和變異系數(shù)來看，經(jīng)60Co－γ及離子束注入后5個雜交組合后代植株的葉寬和葉長的平均值均顯著低于對照組;植株葉長的變異系數(shù)均高于對照組，而葉寬以及葉寬/葉長比的變異系數(shù)均低于對照組，說明經(jīng)60Co－γ和離子束這2種輻射源處理后甜菊雜交后代植株葉長的變異概率增加。

2.2.3 對越冬前腳芽數(shù)量的影響 經(jīng)60Co－γ和離子束注入后甜菊不同雜交組合后代植株越冬前腳芽數(shù)量的變化見表4。

從表4可以看出:經(jīng)60Co－γ注入后‘守田2號’ב中山4號’和‘中山3號’ב守田2號’雜交組合后代植株越冬前萌發(fā)的腳芽數(shù)量顯著低于對照組，而經(jīng)60Co－γ和離子束這2種輻射源處理后其他雜交組合后代的腳芽數(shù)量均與對照組無顯著差異。

從腳芽數(shù)量的平均值和變異系數(shù)看，經(jīng)60Co－γ和離子束注入后，5個甜菊雜交組合后代植株在越冬前萌發(fā)的腳芽數(shù)量平均值均顯著低于對照組，而腳芽數(shù)量的變異系數(shù)均顯著高于對照組，表明60Co－γ和離子束注入對甜菊雜交后代植株越冬前腳芽的萌發(fā)有較大影響，從而也說明輻射誘變是甜菊抗寒后代選育的有效方法之一［22］。

表3 60Co－γ和離子束注入對甜菊不同雜交組合后代幼苗葉部形態(tài)性狀的影響(±SE)1)Table 3 Effects of60Co-γ and ion beam injections on leaf morphological character of progeny seedlings of different cross combinations of Stevia rebaudiana Bertoni(±SE)1)

表3 60Co－γ和離子束注入對甜菊不同雜交組合后代幼苗葉部形態(tài)性狀的影響(±SE)1)Table 3 Effects of60Co-γ and ion beam injections on leaf morphological character of progeny seedlings of different cross combinations of Stevia rebaudiana Bertoni(±SE)1)

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)Different small letters in the same column indicate the significant difference(P＜0.05).2)Ⅰ:‘守田2號’ב中山3 號’‘Shoutian No.2’בZhongshan No.3’;Ⅱ:‘守田2 號’ב中山4 號’‘Shoutian No.2’בZhongshan No.4’;Ⅲ:‘中山3號’ב守田2號’‘Zhongshan No.3’בShoutian No.2’;Ⅳ:‘中山3 號’ב守田3號’‘Zhongshan No.3’בShoutian No.3’;Ⅴ:‘守田3 號’ב守田3 號’‘Shoutian No.3’בShoutian No.3’.

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表4 60Co－γ和離子束注入對甜菊不同雜交組合后代植株越冬前腳芽數(shù)量的影響(±SE)1)Table 4 Effects of60Co-γ and ion beam injections on rhizome sucker number of progeny seedlings of different cross combinations of Stevia rebaudiana Bertoni before overwintering(±SE)1)

表4 60Co－γ和離子束注入對甜菊不同雜交組合后代植株越冬前腳芽數(shù)量的影響(±SE)1)Table 4 Effects of60Co-γ and ion beam injections on rhizome sucker number of progeny seedlings of different cross combinations of Stevia rebaudiana Bertoni before overwintering(±SE)1)

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)Different small letters in the same column indicate the significant difference(P＜0.05).2)Ⅰ:‘守田2號’ב中山3 號’‘Shoutian No.2’בZhongshan No.3’;Ⅱ:‘守田2 號’ב中山4 號’‘Shoutian No.2’בZhongshan No.4’;Ⅲ:‘中山3號’ב守田2號’‘Zhongshan No.3’בShoutian No.2’;Ⅳ:‘中山3 號’ב守田3號’‘Zhongshan No.3’בShoutian No.3’;Ⅴ:‘守田3 號’ב守田3 號’‘Shoutian No.3’בShoutian No.3’.

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3 討 論

甜菊為異花授粉植物，因此其有性繁殖品種的品質(zhì)極易退化，而甜菊優(yōu)良品種選育與優(yōu)質(zhì)甜菊糖的生產(chǎn)密切相關(guān)。輻射誘導(dǎo)突變是選育植物新品種的快速有效方法之一，其有價值突變體的獲得率主要受被輻射材料、輻射源種類及輻射劑量等因素影響［23－25］。本實驗結(jié)果表明:采用60Co－γ和離子束注入處理甜菊雜交組合F1代種子，有利于部分甜菊雜交組合種子發(fā)芽率和幼苗成活率的提高。Shen等［12］的研究結(jié)果也表明:碳離子注入甜菊種子后，種子萌發(fā)期的合成代謝和呼吸代謝能力明顯強于對照組。輻射在單一性狀改良方面，特別是在降低株高［11］、提高抗性、縮短生育期、改變花色等方面，具有更快更理想的效果［26］。本實驗結(jié)果表明:選取適宜的60Co－γ和離子束注入劑量有助于選育葉形一致、分枝較少、節(jié)間長度較短、株型緊湊、抗倒伏、抗寒的甜菊矮型植株，但這2種處理方式對不同雜交組合后代植株不同性狀的誘變效應(yīng)并不完全一致，說明輻射誘發(fā)的突變具有一定的隨機性，應(yīng)對篩選出來的表型特異的植株進行反復(fù)鑒定，以確定其表型性狀的可靠性和遺傳穩(wěn)定性［27］。

采用傳統(tǒng)雜交育種方法結(jié)合輻射誘變進行甜菊育種，可以提高突變頻率，得到豐富的變異體，增加選擇幾率，縮短育種周期，可為甜菊育種提供豐富的育種材料，但輻射誘變的方法和劑量要根據(jù)實際需要不斷完善。從輻射誘變后甜菊不同雜交組合后代植株的主要形態(tài)指標(biāo)及變異幅度看，利用60Co－γ和離子束輻射誘變在一定程度上拓寬了甜菊的遺傳譜，從而提高了獲得優(yōu)良后代單株的可能性。

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