汪牧耘，李雨晴，朱毅斌，肖云華，唐曉清，王康才

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所，江蘇南京210095)

菘 藍(lán) (Isatis indigotica Linn.)為 十 字 花 科(Brassicaceae)藥用植物，其干燥根為中藥板藍(lán)根，具有清熱解毒、涼血消腫和利咽的功效;其干燥葉為中藥大青葉，具有清熱解毒、抗菌消炎和涼血消斑等功效［1］，均為臨床上常用的大宗中藥材。菘藍(lán)體內(nèi)所含的靛藍(lán)和靛玉紅等吲哚類生物堿是主要活性成分，其含量能在一定程度上反映菘藍(lán)的品質(zhì)。在生產(chǎn)實(shí)踐中，為獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的板藍(lán)根與大青葉藥材，必須采取適當(dāng)?shù)脑耘嗾{(diào)控措施。目前研究者多采用逆境處理的方法控制菘藍(lán)體內(nèi)有效成分的含量。段飛等［2］認(rèn)為:20 mmol·L－1ABA 和 250 mmol·L－1NaCl脅迫處理可提高菘藍(lán)組培苗中靛玉紅含量;唐曉清等［3－4］的研究結(jié)果表明:適度淹水處理能提高菘藍(lán)根部活性成分含量，經(jīng)殺青處理后大青葉中靛藍(lán)和靛玉紅含量總體上呈上升趨勢(shì)。目前尚未見采用植物激素調(diào)控菘藍(lán)中靛藍(lán)和靛玉紅含量的研究報(bào)道。

5－氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是一種廣泛存在于各類生物機(jī)體活細(xì)胞中的非蛋白氨基酸，是所有卟啉類葉綠素和血紅素生物合成的關(guān)鍵前體［5］;是植物體內(nèi)天然存在的、生命活動(dòng)必需的、代謝活躍的生理活性物質(zhì)，可通過生物途徑合成，也可由人工化學(xué)合成;具有無毒副作用且易降解、無殘留的特點(diǎn)，可作為植物的壯苗劑、殺蟲劑、增色劑、綠化劑和落葉劑等使用。施用人工合成的ALA可提高作物的生理活性［6－7］和產(chǎn)量［8－9］。

鑒于此，作者研究了噴施不同濃度5－氨基乙酰丙酸(ALA)對(duì)菘藍(lán)苗期生長(zhǎng)及其體內(nèi)靛藍(lán)和靛玉紅含量的影響，探討適宜的外源ALA施用濃度和方法，以期為菘藍(lán)的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菘藍(lán)種子來源于安徽亳州，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院王康才教授鑒定。于2011年5月26日選擇籽粒飽滿、健壯、無損傷且大小均勻的種子播種于塑料盆(直徑340 mm、高度280 mm)內(nèi)，播種基質(zhì)為按照質(zhì)量比2∶1配制的園土(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%左右的有機(jī)質(zhì))和蛭石混合基質(zhì);出苗后每盆留5株生長(zhǎng)一致的幼苗，常規(guī)管理;待幼苗長(zhǎng)至6～8葉期進(jìn)行ALA處理，種植期間嚴(yán)禁使用農(nóng)藥。

LC－20AT型高效液相色譜儀、UV－VIS檢測(cè)器SPD－20A和N2000型色譜工作站(日本島津公司)。靛藍(lán)對(duì)照品(批號(hào)110716－201111)和靛玉紅對(duì)照品(批號(hào)110717－200606)均購自中國藥品生物制品檢定所;ALA由蘇州益安生物科技有限公司提供;甲醇為色譜純;水為超純水;三氯甲烷為分析純。

1.2 方法

1.2.1 ALA處理 分別吸取質(zhì)量濃度10 g·L－1ALA原液5.00、2.50、1.33 和 1.25 mL，用蒸餾水分別配制成終濃度為50.0、25.0、13.3 和 12.5 mg·L－1的 ALA處理液，以蒸餾水為對(duì)照(CK，0.0 mg·L－1ALA)。

于2011年7月底至8月中旬進(jìn)行ALA處理。每處理9盆，分為3組，分別用相應(yīng)質(zhì)量濃度的ALA處理液處理1次、2次和3次，每次處理間隔10 d，每一濃度重復(fù)3次。于處理的當(dāng)天傍晚噴施ALA處理液，每株均勻噴施10 mL，噴施前均加入體積分?jǐn)?shù)0.01%吐溫－20作展著劑。于第1次處理的10 d后采樣進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)分析，采樣后同時(shí)進(jìn)行第2次ALA處理，以此類推;每次均從各處理中采集15株單株供分析用，其中隨機(jī)取10株用于單株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的測(cè)定。

1.2.2 單株質(zhì)量測(cè)定 將菘藍(lán)單株根與葉分開，采用AR1140型電子天平(上海奧豪斯儀器有限公司，精度0.000 1 g)分別稱取鮮質(zhì)量后置于60℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量，冷卻后稱取干質(zhì)量，計(jì)算平均鮮質(zhì)量和干質(zhì)量。

1.2.3 靛藍(lán)和靛玉紅含量測(cè)定 精密稱取靛玉紅和靛藍(lán)對(duì)照品4.40和1.90 mg，分別用三氯甲烷溶解并定容至25 mL，即為靛玉紅和靛藍(lán)對(duì)照品溶液。分別精密吸取二者對(duì)照品溶液各 1、2、4、6、8、10 和 12 μL，參照文獻(xiàn)［1］的方法進(jìn)行HPLC分析。以色譜峰面積(X)為橫坐標(biāo)、對(duì)照品濃度(Y)為縱坐標(biāo)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行擬合，得到二者的回歸方程分別為Y靛藍(lán)=(2 000×10－4)X靛藍(lán)+(3×10－4)，r=0.999 6(n=3)，線性范圍為5.0 ～ 15.0 μg;Y靛玉紅=(2 000×10－4)X靛玉紅－(10×10－4)，r=0.999 9(n=3)，線性范圍為 0.4 ～20.0 μg。

菘藍(lán)地上部分烘干至恒質(zhì)量，粉碎并過60目篩;精密稱取地上部分粉末0.5 g，加入100 mL三氯甲烷浸泡15 h，然后于80℃水浴中索氏回流提取10 h，提取液減壓濃縮至近干;用三氯甲烷溶解并定容至50 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即為供試樣液。分別吸取各供試樣液5 μL，參照對(duì)照品的色譜條件進(jìn)行HPLC分析;以色譜峰面積并參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中靛藍(lán)和靛玉紅含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 ALA處理對(duì)菘藍(lán)生長(zhǎng)的影響

2.1.1 對(duì)單株質(zhì)量的影響 用不同質(zhì)量濃度ALA噴施1至3次后菘藍(lán)根和葉片的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量見表1。由表1可見:噴施ALA對(duì)菘藍(lán)根的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用。用不同質(zhì)量濃度ALA處理1次后菘藍(lán)單株根干質(zhì)量均高于對(duì)照，除25.0 mg·L－1ALA處理組外，其他處理組與對(duì)照有極顯著差異(P＜0.01);而用不同質(zhì)量濃度ALA處理2次或3次，菘藍(lán)單株根干質(zhì)量均極顯著高于對(duì)照。用不同質(zhì)量濃度ALA處理1次后菘藍(lán)單株根鮮質(zhì)量也均高于對(duì)照，差異達(dá)極顯著水平;而用不同質(zhì)量濃度ALA處理2次或3次，單株根鮮質(zhì)量或低于對(duì)照或高于對(duì)照，其中用25.0 mg·L－1ALA處理2次，單株根鮮質(zhì)量極顯著高于對(duì)照;用13.3 和12.5 mg·L－1ALA 處理3 次，單株根鮮質(zhì)量極顯著高于對(duì)照。

表1 用5－氨基乙酰丙酸(ALA)處理不同次數(shù)對(duì)菘藍(lán)根和葉片鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的影響(n=10)1)Table 1 Effect of 5-aminolevulinic acid(ALA)treating for different times on fresh and dry weights of root and leaf of Isatis indigotica Linn.(n=10)1)

噴施不同質(zhì)量濃度ALA溶液對(duì)菘藍(lán)葉的生長(zhǎng)有不同作用。用不同質(zhì)量濃度ALA處理3次，菘藍(lán)單株葉片干質(zhì)量和鮮質(zhì)量均高于對(duì)照，差異達(dá)極顯著水平(P＜0.01);而用不同質(zhì)量濃度ALA處理1次或2次，葉片干質(zhì)量和鮮質(zhì)量或高于對(duì)照或低于對(duì)照，其中用12.5 mg·L－1ALA處理1次或2次，葉片干質(zhì)量和鮮質(zhì)量極顯著高于對(duì)照(P＜0.01)。

由此可見，多次噴施低濃度ALA對(duì)菘藍(lán)營養(yǎng)期生長(zhǎng)尤其是葉片生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

2.1.2 對(duì)根冠比的影響 用不同質(zhì)量濃度ALA噴施1至3次后菘藍(lán)根冠比的變化見表2。結(jié)果表明:采用不同質(zhì)量濃度ALA處理1次，菘藍(lán)的根冠比均高于對(duì)照。除13.3 mg·L－1ALA處理組外，用不同質(zhì)量濃度ALA處理2次后菘藍(lán)的根冠比均高于對(duì)照，說明在菘藍(lán)營養(yǎng)期的早、中期噴施ALA可以促進(jìn)其地上部分的生長(zhǎng)。用不同質(zhì)量濃度ALA處理3次，菘藍(lán)的根冠比均明顯低于對(duì)照，說明隨著噴施次數(shù)的增加菘藍(lán)地上部分的生長(zhǎng)快于地下部分。

表2 用5－氨基乙酰丙酸(ALA)處理不同次數(shù)對(duì)菘藍(lán)根冠比的影響(n=10)Table 2 Effect of 5-aminolevulinic acid(ALA)treating for different times on root-shoot ratio of Isatis indigotica Linn.(n=10)

2.2 ALA處理對(duì)菘藍(lán)中靛藍(lán)和靛玉紅含量的影響

2.2.1 對(duì)靛藍(lán)含量的影響 用不同質(zhì)量濃度ALA噴施1至3次后菘藍(lán)葉片中靛藍(lán)含量的變化見表3。由表3可見:用不同質(zhì)量濃度ALA處理不同次數(shù)后，葉片中靛藍(lán)含量均高于對(duì)照。用不同質(zhì)量濃度ALA處理1次后，靛藍(lán)含量均顯著高于對(duì)照(P＜0.05);其中，12.5 mg·L－1ALA 處理組的靛藍(lán)含量最高，與其他處理組和對(duì)照間均有極顯著差異(P＜0.01)。用不同質(zhì)量濃度ALA處理2次后，葉片中靛藍(lán)含量也均高于對(duì)照，差異達(dá)極顯著水平(P＜0.01);其中，50.0和12.5 mg·L－1ALA處理組靛藍(lán)含量較高。用不同質(zhì)量濃度ALA處理3次后，葉片中靛藍(lán)含量也均高于對(duì)照，差異達(dá)顯著水平(P＜0.05);其中，12.5 mg·L－1ALA 處理組靛藍(lán)含量最高，達(dá)到 22.51 μg·g－1。

表3 用5－氨基乙酰丙酸(ALA)處理不同次數(shù)后菘藍(lán)葉片中靛藍(lán)含量的變化(±SD，n=3)1)Table 3 Change of indigo content in leaf of Isatis indigotica Linn.treated by 5-aminolevulinic acid(ALA)for different times(±SD，n=3)1)

表3 用5－氨基乙酰丙酸(ALA)處理不同次數(shù)后菘藍(lán)葉片中靛藍(lán)含量的變化(±SD，n=3)1)Table 3 Change of indigo content in leaf of Isatis indigotica Linn.treated by 5-aminolevulinic acid(ALA)for different times(±SD，n=3)1)

1)同列中不同的小寫字母和大寫字母分別表示差異顯著(P=0.05)和極顯著(P=0.01)Different small letters and capitals in the same column indicate the significant difference(P=0.05)and the extremely significant difference(P=0.01)，respectively.

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由表3還可見:隨處理次數(shù)的增多，菘藍(lán)葉片中的靛藍(lán)含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，其中對(duì)照組靛藍(lán)含量由 14.83 μg·g－1增加至 17.83 μg·g－1;隨處理次數(shù)的增多，各處理組靛藍(lán)含量的變化趨勢(shì)與對(duì)照組基本一致。總體上看，用 12.5 和 13.3 mg·L－1ALA 處理后靛藍(lán)含量較高，說明用較低濃度ALA處理2次或3次有利于菘藍(lán)葉片中靛藍(lán)的積累。

2.2.2 對(duì)靛玉紅含量的影響 用不同質(zhì)量濃度ALA噴施1至3次后菘藍(lán)葉片中靛玉紅含量的變化見表4。由表4可見:用不同質(zhì)量濃度ALA處理1次，葉片中靛玉紅含量均高于對(duì)照，其中，50.0、13.3 和 12.5 mg·L－1ALA處理組靛玉紅含量極顯著高于對(duì)照(P＜0.01)，以 12.5 mg·L－1ALA 處理組靛玉紅含量最高，達(dá)17.29 μg·g－1。用不同質(zhì)量濃度 ALA 處理 2 次，葉片中靛玉紅含量均高于對(duì)照，且各處理組與對(duì)照有極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)差異;其中，12.5 mg·L－1ALA處理組菘藍(lán)葉片中的靛玉紅含量最高，達(dá)84.14 μg·g－1。用不同質(zhì)量濃度 ALA 處理 3 次，25和50 mg·L－1ALA處理組靛玉紅含量均低于對(duì)照，而13.3 和12.5 mg·L－1ALA 處理組靛玉紅含量均極顯著高于對(duì)照(P＜0.01);其中，13.3 mg·L－1ALA 處理組靛玉紅含量最高，達(dá) 99.48 μg·g－1。

由表4還可見:隨菘藍(lán)的生長(zhǎng)(或處理次數(shù)的增加)，各處理組及對(duì)照組葉片中靛玉紅含量的變化趨勢(shì)有一定差異。其中，50.0、25.0 和 12.5 mg·L－1處理組以及對(duì)照組的靛玉紅含量均呈現(xiàn)低—高—低的變化趨勢(shì)，僅變化幅度有所不同;而 13.3 mg·L－1ALA處理組的靛玉紅含量隨處理次數(shù)的增加呈逐漸增加的趨勢(shì)。另外，處理2次后各處理組和對(duì)照組的靛玉紅含量均大幅度高于處理1次，差異甚至達(dá)到約5倍。說明用低濃度ALA多次處理有利于菘藍(lán)葉片內(nèi)靛玉紅的積累。

表4 用5－氨基乙酰丙酸(ALA)處理不同次數(shù)后菘藍(lán)葉片中靛玉紅含量的變化(±SD，n=3)1)Table 4 Change of indirubin content in leaf of Isatis indigotica Linn.treated by 5-aminolevulinic acid(ALA)for different times(±SD，n=3)1)

表4 用5－氨基乙酰丙酸(ALA)處理不同次數(shù)后菘藍(lán)葉片中靛玉紅含量的變化(±SD，n=3)1)Table 4 Change of indirubin content in leaf of Isatis indigotica Linn.treated by 5-aminolevulinic acid(ALA)for different times(±SD，n=3)1)

1)同列中不同的小寫字母和大寫字母分別表示差異顯著(P=0.05)和極顯著(P=0.01)Different small letters and capitals in the same column indicate the significant difference(P=0.05)and the extremely significant difference(P=0.01)，respectively.

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3 討論和結(jié)論

作為一種促生長(zhǎng)劑，ALA在農(nóng)作物栽培生產(chǎn)中的應(yīng)用備受關(guān)注。ALA能提高椰棗(Phoenix dactylifera Linn.)品種的產(chǎn)量，改善其果實(shí)的品質(zhì)［10］;低濃度ALA能提高辣椒(Capsicum annuum Linn.)幼苗對(duì)冷脅迫的耐受力，促進(jìn)其生長(zhǎng)［11］;ALA能通過提高血紅素蛋白質(zhì)的活力有效保護(hù)大豆〔Glycine max(Linn.)Merr.〕植株因冷應(yīng)激造成的破壞性影響［12］;而將 ALA用于藥用植物的研究目前主要集中于種子萌發(fā)及其幼苗生理特性方面［13－14］。菘藍(lán)作為中藥材板藍(lán)根和大青葉的基原植物，通過適宜的栽培措施對(duì)其生長(zhǎng)及活性成分含量進(jìn)行調(diào)控，是獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)藥材原料的前提;采取適當(dāng)?shù)脑耘嗾{(diào)控措施提高靛藍(lán)與靛玉紅的含量也有助于其藥材質(zhì)量的提高。在本研究中，噴施不同質(zhì)量濃度ALA均能促進(jìn)菘藍(lán)根干物質(zhì)的積累，其中較低質(zhì)量濃度(12.5和13.3 mg·L－1)ALA 不但對(duì)其生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用，還能促進(jìn)菘藍(lán)地上部分干物質(zhì)的積累，且隨ALA處理次數(shù)增加，干物質(zhì)積累量也逐漸增加。說明ALA可能是通過增強(qiáng)葉片光合作用促進(jìn)光合產(chǎn)物積累，從而促使根部生長(zhǎng)。Al-Qurashia等［10］也得出了類似的研究結(jié)果。

ALA處理對(duì)菘藍(lán)葉片中靛藍(lán)和靛玉紅含量均有影響，其中，用較低質(zhì)量濃度ALA進(jìn)行處理能有效提高靛藍(lán)和靛玉紅的含量;但用較高質(zhì)量濃度(25.0和50.0 mg·L－1)ALA處理3次則不利于靛玉紅積累。靛玉紅作為藥材大青葉的質(zhì)量控制指標(biāo)，其含量不得低于0.02%［1］，在菘藍(lán)苗期用ALA處理1次后靛玉紅含量均低于此標(biāo)準(zhǔn)，但處理2次或3次后靛玉紅含量均高于此標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合菘藍(lán)生長(zhǎng)狀況，建議在生產(chǎn)中選用較低濃度ALA進(jìn)行處理，處理次數(shù)以2次或3次為宜，可一定程度提高菘藍(lán)的產(chǎn)量和質(zhì)量。

目前ALA在藥用植物栽培生產(chǎn)中的應(yīng)用尚未見系統(tǒng)的研究報(bào)道。ALA處理對(duì)菘藍(lán)葉片中靛藍(lán)和靛玉紅含量的影響有差異，其作用機(jī)制是否與靛藍(lán)和靛玉紅結(jié)構(gòu)差異有關(guān)?尚需進(jìn)一步研究探討。

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