遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 遼寧 大連 116600

葒草花為蓼科植物紅蓼Polygonum orientale L.的花序，具有行氣活血、消積止痛的功效，用于治療頭痛，心胃氣痛，腹中痞積，小兒疳積等癥[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，葒草花在抗人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖作用方面效果較好，且紅蓼的果實(shí)、莖葉均具有一定的抗腫瘤作用[2、3]?；瘜W(xué)成分研究顯示，葒草花的主要成分為黃酮類化合物[4]。黃酮類化合物對于腫瘤細(xì)胞的增長繁殖具有顯著的抑制作用[5]。葒草花的抗腫瘤活性部位的篩選和相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究報道還處于初步探索階段。本文采用了MTT法，對葒草花各不同溶媒萃取物進(jìn)行了人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人肝癌SMMC-7721細(xì)胞體外活性篩選，為葒草花抗腫瘤的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株 人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721由上海復(fù)蒙生物有限公司提供。

1.2 藥物與試劑 葒草花采自遼寧省大連市南關(guān)嶺，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為葒草Polygonum orientale L. 的花序；胰蛋白酶(Trypsin)、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基噻唑藍(lán)(MTT)(美國Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；胎牛血清(北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所)；其他試劑皆為分析純；實(shí)驗(yàn)中所用溶液都是由Mili-Q水配制而成。

1.3 主要儀器 CJT-808型超凈臺(沈陽市醫(yī)療器械二廠)；酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；NUAIRETM US AUTOFLOW型二氧化碳培養(yǎng)箱(德國NuAir公司)；AE3型細(xì)胞倒置相差顯微鏡(德國Motic公司)；96孔培養(yǎng)板(美國Corning公司)；ACCULAB ALC-11C.4型電子分析天平(德國Sartorius Group公司)；Mill-Q型超純水機(jī)(美國Millipore公司)。

2 方法

2.1 藥物制備 稱取葒草花100g粉碎至60目，用90%、60%、30%的乙醇分別回流提取三次，每次2 h，合并提取液，回收溶劑得醇提浸膏。依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取數(shù)次，回收溶劑得乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取部位。各分部萃取部位制成10mg/ml母液，過0.22μm微孔濾器過濾除菌，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞按貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法接種于含10%滅活胎牛血清的DEME培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn) 采用MTT法測定各萃取部位的抗腫瘤活性。選用對數(shù)生長期的貼壁腫瘤細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液后，用含10%小牛血清的DEME培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度分別為 5×104個/ml，以每孔100μl的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，置于5%CO2及飽和濕度下的培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)細(xì)胞24h。各萃取部位母液用培養(yǎng)基稀釋為50、150、450μg/ml，每組設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)對照組(對照組加等體積溶劑的培養(yǎng)液)，置于5% CO2及飽和濕度下的培養(yǎng)箱內(nèi)37℃。繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)板每孔避光加入50μl MTT，繼續(xù)以同樣的條件孵育4h后，棄去上清液，每孔加入l50μl DMSO振蕩混勻，10min后，于酶標(biāo)儀上492nm波長處檢測各孔的光密度OD值，按下式計(jì)算藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率[6]。

腫瘤細(xì)胞生長抑制率(%)

=[1-D(λ)實(shí)驗(yàn)組/D(λ)對照組]×100%

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

由表1可知，乙酸乙酯部位和正丁醇部位對人宮頸癌細(xì)胞HeLa和人肝癌細(xì)胞SMMC-7721均具有較好的抑制作用。從量效關(guān)系上看，當(dāng)藥物濃度較低(50μg/ml)時，藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用不明顯。隨著用藥濃度的升高，藥物對各細(xì)胞的抑制作用均增強(qiáng)，且出現(xiàn)良好的劑量依賴性；在作用濃度為450μg/ml時各萃取部位均具有較好的抑制作用，其中乙酸乙酯部位優(yōu)于正丁醇部位，且對于SMMC-7721細(xì)胞較為敏感，乙酸乙酯部位抑制率在24h 和48h分別為44.47%，59.36%；隨著藥物作用時間的延長，藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制率也隨之升高。

表1 葒草花不同提取部位對腫瘤細(xì)胞的影響 (n=5)

4 討論

4.1 近年來，從中藥中篩選有效抗腫瘤活性成分已逐漸受到人們的重視。文獻(xiàn)報道從葒草花中分離得到了9個化合物，主要為黃酮類[8]，這些成分對于抗腫瘤活性化合物的篩選具有廣闊的開發(fā)前景。葒草花為民間及民族常用中藥，具有行氣活血，消積止痛的功效?，F(xiàn)代研究表明，葒草花還具有一定的抗腫瘤作用[2]。但有關(guān)葒草花的藥理研究文獻(xiàn)極少，尤其是葒草花對人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的篩選還未見報道。本實(shí)驗(yàn)為葒草花活性部位的篩選提供了參考，為擴(kuò)大葒草花的應(yīng)用提供了藥理研究基礎(chǔ)，其藥用機(jī)理和體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)有待深入研究和探索。

4.2 實(shí)驗(yàn)通過MTT法篩選了葒草花的乙酸乙酯部位及正丁醇部位在三個不同濃度(50、150、450μg/ml)對腫瘤細(xì)胞的體外抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葒草花的各萃取部位對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞比較敏感；乙酸乙酯部位對HeLa細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞的抑制率分別為59.36%、74.29%；而正丁醇部位對上述兩種腫瘤細(xì)胞的抑制率可達(dá)43.33%和69.87%；乙酸乙酯部位的抗腫瘤作用優(yōu)于正丁醇部位，但兩者均具有不同程度的抗腫瘤活性，對其抗腫瘤活性成分仍有進(jìn)一步研究的價值。

4.3 從量效關(guān)系上看，葒草花的不同萃取部位均對細(xì)胞具有增值抑制作用，且腫瘤的抑制率與時間和劑量呈線性關(guān)系；隨著給藥劑量的增加，腫瘤抑制率也隨之增強(qiáng)，給藥劑量為450μg/ml時的腫瘤抑制率驟然增高，明顯高于給藥劑量為50μg/ml和150μg/ml。隨著作用時間的增加，對腫瘤細(xì)胞的增值抑制作用也隨之增強(qiáng)，48h的抑瘤率明顯高于24h的抑瘤率。

[1] 國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會．中華本草(第二冊)[M]．上海：上?？萍汲霭嫔纾?998：681-683．

[2] 宋青，樓一層．紅蓼對腫瘤細(xì)胞的作用研究[J]．中國藥師，2009，12(10)：1340-1342．

[3] 翟延君．水紅花子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化研究[D]．沈陽：遼寧中醫(yī)學(xué)院，2005．

[4] 陳秋榮．黃酮類化合物藥理作用的分析[J]．中國實(shí)用醫(yī)藥，2012，7(21)：254-255．

[5] 李勇軍，何迅，劉志寶，等．葒草花化學(xué)成分的研究[J]．中國中藥雜志，2009，34(20)：2613-2614．

[6] 徐叔云，卞如濂，陳修．藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)(第二版)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1785．

[7] 楊芳，路國華，劉利兵，等．影響MTT比色試驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[J]．第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2009，30(3)：243.

[8] 李勇軍，何迅，劉志寶，等．葒草花化學(xué)成分的研究[J]．中國中藥雜志，2009，34(20)：2613-2614．