朱向東，王 燕

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論教研室，甘肅 蘭州730000;2.甘肅中醫(yī)學(xué)院方劑學(xué)教研室，甘肅蘭州730000)

糖尿病性白內(nèi)障(diabetic cataract，DC)是糖尿病患者致盲的重要原因之一，研究其發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療方法是眼科學(xué)界需要解決的重大課題之一?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究［1］認(rèn)為：DC的發(fā)病機(jī)制主要包括晶狀體蛋白的非酶糖基化學(xué)說、滲透損傷學(xué)說和氧化損傷學(xué)說。近年來研究認(rèn)為：晶狀體多元醇通路的異?；钴S也是DC發(fā)病的重要機(jī)制。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：肝開竅于目，而肝腎同源，因此，對(duì)于老年人因糖尿病引發(fā)的白內(nèi)障宜多從肝腎虧虛論治。五子衍宗丸是治療腎精虧虛引發(fā)的不孕、不育癥的經(jīng)典方，筆者依據(jù)中醫(yī)異病同治的精神，臨床用于治療DC效果顯著。本實(shí)驗(yàn)研究從氧化損傷和多元醇通路的角度探討五子衍宗丸治療DC的作用機(jī)制，以期為五子衍宗丸的進(jìn)一步運(yùn)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SPF級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20±1)g，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，均由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供。SPF級(jí)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為SCXKC(甘)2004-0006-000020，SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號(hào)為SYXKC(甘)2004-0006-0001561。

1.2 試劑與儀器

D-半乳糖(C6H12O6)，分子量180，上海生化制劑廠產(chǎn)品，批號(hào)20030805。100 g/L D-半乳糖溶液的配制方法：準(zhǔn)確稱取D-半乳糖粉末25 g置于燒杯中，用適量的蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)于250 mL容器中，加蒸餾水至刻度，靜置后放入冰箱中貯藏備用。五子衍宗丸，北京同仁堂股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)2030142，成人口服，1次6 g，1 d 2次(動(dòng)物用劑量按體表面積法折算)。氯化鈉注射液，甘肅扶正制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)200010081-1;維生素C片，西安利君精華藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，批號(hào)20030604。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號(hào)20060214)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(批號(hào) 20060217)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號(hào)20060121)，均由南京建成生物工程研究所提供。JY4001電子天平，上海天平儀器廠產(chǎn)品;UV-9100紫外分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司產(chǎn)品;KDC-2044低速冷凍離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司產(chǎn)品;裂隙燈、Dionex 4500 I HPIC/HPIC色譜儀，蘇州醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組、模型的建立與給藥

將50只小鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、維生素C組、五子衍宗丸預(yù)防組和五子衍宗丸治療組5組，每組10只。造模方法［1］：除空白對(duì)照組外，其余4組以左手抓住小鼠，使腹部向上，碘伏消毒后下部，右手將注射針頭于左下腹部刺入，使針頭向前推進(jìn) 0.5～1.0 cm，再以45°角穿過腹肌固定針頭，緩緩注入100 g/L半乳糖溶液25 mL/(kg·d)。空白對(duì)照組以同樣方法腹腔注射相應(yīng)劑量生理鹽水。1次/d，造模時(shí)間20 d。模型對(duì)照組、維生素C組、五子衍宗丸治療組造模時(shí)不給藥，五子衍宗丸預(yù)防組造模同時(shí)以五子衍宗丸水煎劑灌胃預(yù)防，劑量為1.875 g/(kg·d)(相當(dāng)于60 kg成人劑量的5倍)，至造模結(jié)束。造模結(jié)束后，維生素C組以維生素C水溶劑灌胃治療，劑量為0.31 g/(kg·d)(相當(dāng)于60 kg成人劑量的5倍);五子衍宗丸治療組用五子衍宗丸水煎劑灌胃治療，劑量為1.875 g/(kg·d)(相當(dāng)于60 kg成人劑量的5倍)，連續(xù)20 d。等效劑量按人與動(dòng)物體型系數(shù)折算［2］，受試動(dòng)物給藥容積均為0.01 mL/g 體質(zhì)量。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 晶狀體混濁度

除空白對(duì)照組外，其余4組在造模結(jié)束后檢查晶狀體混濁度，然后斷頭處死模型對(duì)照組、五子衍宗丸預(yù)防組小鼠，低溫條件下快速摘取晶狀體并采血;空白對(duì)照組、維生素C組、五子衍宗丸治療組在治療后檢查晶狀體混濁度，然后處死，摘取晶狀體并采血。

晶狀體混濁度按照以下分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，共分5級(jí)［2］：Ⅰ級(jí)，無混濁(晶狀體透明清亮);Ⅱ級(jí)，較混濁(僅赤道部有空泡);Ⅲ級(jí)，明顯混濁(空泡擴(kuò)展到中央);Ⅳ級(jí)，核混濁(晶狀體只在中央呈現(xiàn)核性白內(nèi)障);Ⅴ級(jí)，整個(gè)晶狀體完全性白內(nèi)障。

1.4.2 血糖、血清胰島素、糖化血清蛋白指數(shù)

各實(shí)驗(yàn)組小鼠于給藥前及給藥20 d分別測(cè)定血糖(以微量血血糖監(jiān)測(cè)儀檢測(cè))和血清胰島素(以放免測(cè)定法測(cè)定)，給藥20 d以NBT還原反應(yīng)法測(cè)定糖化血清蛋白指數(shù)。

1.4.3 晶狀體SOD活力、GSH-Px活力、MDA含量和糖醇含量

取小鼠晶狀體組織以冰冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱質(zhì)量后用眼科小剪刀盡快剪碎，置于勻漿器中加適量生理鹽水，在玻璃勻漿器內(nèi)研磨5 min，以3500 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行下述指標(biāo)測(cè)定：SOD活力測(cè)定，采用黃嘌呤氧化酶法;GSH-Px活力測(cè)定，以催化還原型谷胱甘肽GSH的反應(yīng)速度來表示;MDA含量測(cè)定，采用硫代巴比妥酸TBA法。另取晶狀體組織以4℃蒸餾水沖洗后，以精密電子天秤稱量質(zhì)量，低溫(4℃)下勻漿、高速(3000 r/min)低溫離心后，脫蛋白，取上清液用 Dionex 4500 I HPIC/HPIC色譜儀測(cè)定晶狀體的葡萄糖、果糖、山梨醇含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將所測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果按試劑盒說明書相應(yīng)公式計(jì)算，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。晶狀體混濁程度采用Ridit分析法，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)()±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，根據(jù)方差齊性采用單因素方差分析(One-Way-ANOVN)。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠晶狀體混濁度對(duì)比

空白對(duì)照組小鼠晶狀體未出現(xiàn)混濁，晶狀體呈透明清亮。隨著半乳糖注射量的積累，在造模結(jié)束后，模型對(duì)照組小鼠有4只眼睛晶狀體出現(xiàn)輕度混濁，6只高度混濁;維生素C組小鼠有5只眼睛晶狀體輕度混濁，5只高度混濁;五子衍宗丸預(yù)防組有6只眼睛晶狀體無混濁，2只輕度混濁，2只高度混濁，保持晶狀體透明百分率達(dá)60%;五子衍宗丸治療組有4只眼睛晶狀體輕度混濁，6只高度混濁。在治療后，維生素C組有4只眼睛晶狀體無混濁，5只輕度混濁，1只高度混濁;五子衍宗丸治療組有6只眼睛晶狀體無混濁，4只輕度混濁，未檢查到晶狀體高度混濁的現(xiàn)象。見表1。

表1 各組小鼠晶狀體混濁度對(duì)比n=10，±s

表1 各組小鼠晶狀體混濁度對(duì)比n=10，±s

注：因小鼠瞳孔小，無法區(qū)別Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)與Ⅴ期級(jí)，故將3者合為Ⅲ級(jí)統(tǒng)計(jì)。

組 別 劑量 Ⅰ級(jí) Ⅱ級(jí) Ⅲ級(jí)10 0 0模型對(duì)照組 0 0 4 6五子衍宗丸預(yù)防組 1.875 g·(kg·d)-1 6 2 2維生素 C 組 0.31 g·(kg·d)-1 4 5 1五子衍宗丸治療組 1.875 g·(kg·d)-1空白對(duì)照組0 6 4 0

2.2 各組小鼠血糖、糖化血清蛋白指數(shù)和血清胰島素對(duì)比

與空白對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組小鼠血糖、糖化血清蛋白指數(shù)升高，胰島素水平降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，五子衍宗丸治療組、預(yù)防組和維生素C治療組小鼠的血糖水平和糖化血清蛋白指數(shù)均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與維生素C組對(duì)比，五子衍宗丸治療組兩指標(biāo)降低更為明顯 (P＜0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血糖、糖化血清蛋白指數(shù)和血清胰島素對(duì)比±s

表2 各組小鼠血糖、糖化血清蛋白指數(shù)和血清胰島素對(duì)比±s

注：與空白對(duì)照組對(duì)比，＊＊ P＜ 0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比，##P＜ 0.01;與維生素C組對(duì)比，△ P＜0.05，△△ P＜ 0.01。

組 別 動(dòng)物數(shù) 血糖/(mmol·L-1) 糖化血紅蛋白指數(shù)/10 胰島素/(nmol·L-1)10 4.83 ±1.86 213.3 ±16.23 30.42 ±17.05模型對(duì)照組 10 24.86±6.81＊＊ 426.4 ±32.5＊＊ 7.89 ±4.36＊＊維生素 C 組 10 15.68 ±6.12## 335.0 ±32.64## 13.75 ±4.66五子衍宗丸預(yù)防組 10 10.15±5.82##△ 271.9±21.11##△ 8.89±7.98△五子衍宗丸治療組 10 7.40±2.63##△△ 218.7±15.32##△△ 20.88±4.26##△△空白對(duì)照組

2.3 各組小鼠晶狀體SOD、GSH-Px、MDA對(duì)比

與空白對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組小鼠晶狀體組織SOD、GSH-Px的活力降低，MDA含量升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01、P＜0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，五子衍宗丸治療組、預(yù)防組小鼠SOD、GSH-Px活力升高、MDA含量降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05 或 P ＜0.01)。見表3。

表3 各組小鼠晶狀體SOD、GSH-Px、MDA對(duì)比n=10，±s

表3 各組小鼠晶狀體SOD、GSH-Px、MDA對(duì)比n=10，±s

注：與空白對(duì)照組對(duì)比，*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比 ，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組 別 劑量 SOD/(U·mgprot-1) GSH-Px/(U·mgprot-1) MDA/(μmol·gprot-1)60.52 ±15.17 14.30 ±3.31 6.12 ±0.38模型對(duì)照組 0 32.26±10.32＊＊ 8.54 ±1.25＊＊ 8.32±0.36*維生素 C 組 0.31 g·(kg·d)-1 49.86 ±24.88## 11.02 ±2.23## 8.03 ±0.25五子衍宗丸預(yù)防組 1.875 g·(kg·d)-1 42.56 ±12.36## 10.58 ±4.82## 7.82 ±0.56#五子衍宗丸治療組 1.875 g·(kg·d)-1 50.42 ±17.32## 11.89 ±1.25# 6.72 ±0.58空白對(duì)照組0#

2.4 各組小鼠晶狀體組織糖醇含量對(duì)比

與空白對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組小鼠晶狀體組織中葡萄糖、果糖、山梨醇含量升高 ，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。表明DC小鼠晶狀體組織中存在明顯的葡萄糖、果糖山梨醇蓄積，其多元醇通路異?；钴S。與模型對(duì)照組對(duì)比，五子衍宗丸治療組、預(yù)防組小鼠晶狀體組織中葡萄糖、果糖、山梨醇含量降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與維生素C組對(duì)比，五子衍宗丸治療組降低更為明顯(P＜0.05)。表明五子衍宗丸能有效抑制DC小鼠晶狀體組織多元醇通路的異常活躍。見表4。

表4 各組小鼠晶狀體組織葡萄糖、果糖、山梨醇含量對(duì)比 μmol·(g·wet)-1，±s

表4 各組小鼠晶狀體組織葡萄糖、果糖、山梨醇含量對(duì)比 μmol·(g·wet)-1，±s

注：與空白對(duì)照組對(duì)比，＊＊ P ＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比，#P ＜0.05 ，##P ＜0.01;與維生素 C 組對(duì)比，△ P ＜0.05，△△ P ＜0.01。

組動(dòng)物數(shù) 葡萄糖 山梨醇 果糖空白對(duì)照組別10 4.08 ±0.73 3.05 ±1.32 1.86 ±0.31模型對(duì)照組 10 16.32±4.88＊＊ 31.49±9.76＊＊ 7.91 ±1.63＊＊維生素 C 組 10 11.01 ±3.18## 17.80 ±5.81## 6.07 ±1.48#五子衍宗丸預(yù)防組 10 10.86±3.93## 12.56±4.30##△ 3.41±0.91##△五子衍宗丸治療組 10 9.67±2.54##△ 9.42±2.67##△△ 2.73±0.79##△

3 討論

糖尿病性白內(nèi)障(DC)已成為糖尿病并發(fā)癥中僅次于視網(wǎng)膜病變的第二大眼病。我國2型糖尿病患者中白內(nèi)障發(fā)病率高達(dá)62.37%，且發(fā)病率隨糖尿病病程延長(zhǎng)而顯著增加，給糖尿病患者帶來巨大痛苦。已經(jīng)有研究［1］證實(shí)：蛋白質(zhì)的糖基化在糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，晶狀體氧化損傷、多元醇通路異常也參與DC的發(fā)生發(fā)展。DC一旦發(fā)生，治療難度大，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)除了手術(shù)外，無特效藥物治療。近年來中醫(yī)藥防治DC取得了很大進(jìn)展，尤其是在其發(fā)病早期，可通過辨證論治、整體調(diào)節(jié)而收到較好療效。五子衍宗丸出自《證治準(zhǔn)繩》，由枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子和車前子5味藥組成，具有補(bǔ)腎益精的作用［3］。筆者臨床運(yùn)用五子衍宗丸加減治療DC取得了明顯療效，但其作用機(jī)制不明。本實(shí)驗(yàn)從氧化損傷和多元醇通路的角度，進(jìn)一步探討其防治DC的作用機(jī)制。

晶狀體的氧化損傷被認(rèn)為是DC的一個(gè)主要激發(fā)因素［2］。有研究［2］表明：DC 大鼠晶狀體中的VC、SOD及GSH-Px活性明顯下降，臨床上補(bǔ)充抗氧化劑能有效改善DC;而且氧化損傷的發(fā)生與血糖上升有關(guān)，血糖水平增高可增加晶狀體中的自由基，因此氧化損傷與晶狀體抗氧化防御系統(tǒng)的紊亂在DC的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。SOD和GSH-Px是公認(rèn)的機(jī)體酶促類自由基防御系統(tǒng)，對(duì)清除自由基、保護(hù)細(xì)胞組織起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：模型對(duì)照組小鼠晶狀體中MDA含量比空白對(duì)照組明顯增高，而SOD、GSH-Px活性明顯下降，說明DC小鼠晶狀體中酶促類自由基防御系統(tǒng)受到明顯破壞，抗氧化能力明顯降低。五子衍宗丸能顯著提高SOD、GSH-Px活力，減少M(fèi)DA含量，說明五子衍宗丸具有清除氧自由基，抗氧化損傷，維持晶狀體抗氧化防御系統(tǒng)平衡的作用。

多元醇通路的異常活躍是DC發(fā)病的一個(gè)重要機(jī)制［3-4］。在正常情況下，晶狀體的糖代謝有無氧酵解、有氧酵解、磷酸戊糖旁路和多元醇途徑等4種主要形式。其中，通過無氧酵解將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳糖是晶狀體糖代謝的最主要形式，提供其所需能量的70%～90%。大約只有5%的葡萄糖經(jīng)過多元醇通路還原為山梨醇，山梨醇在山梨醇脫氫酶的作用下被氧化成果糖［5］。多元醇通路被激活的原因就是高血糖。當(dāng)血糖水平明顯升高，葡萄糖通過輔助彌散大量進(jìn)入晶狀體，醛糖還原酶被激活，從而激活多元醇通路，大量的葡萄糖轉(zhuǎn)化為山梨醇，進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)楣牵瑢?dǎo)致山梨醇、果糖在細(xì)胞中堆積，細(xì)胞內(nèi)呈高滲狀態(tài)，致使晶狀體水腫，各種營養(yǎng)物質(zhì)無法進(jìn)入晶狀體內(nèi)，氨基酸減少，蛋白質(zhì)被聚合，晶狀體產(chǎn)生混濁，引起高滲性損害［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：模型對(duì)照組小鼠晶狀體組織中山梨醇、葡萄糖和果糖的含量明顯增加，說明在DC狀態(tài)下可能其多元醇通路異?；钴S。經(jīng)五子衍宗丸治療后，DC小鼠晶狀體組織中山梨醇、葡萄糖和果糖的含量明顯下降，說明五子衍宗丸具有抑制DC小鼠晶狀體組織多元醇通路的異?；钴S，從而減輕組織細(xì)胞的損傷的作用。另外，實(shí)驗(yàn)還觀察到，五子衍宗丸在降低DC小鼠的血糖和糖化血清蛋白指數(shù)，以及增加血清胰島素水平方面的作用均明顯優(yōu)于維生素C組。因此，良好地控制血糖水平可能是五子衍宗丸抑制DC小鼠晶狀體組織多元醇通路異?；钴S的一個(gè)重要途徑。晶狀體混濁度檢查結(jié)果也與上述結(jié)果一致，說明：五子衍宗丸可能是通過減輕小鼠的氧化損傷和抑制多元醇通路異?；钴S而延緩或者治療DC的，其深層次的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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