何軍鋒，嚴(yán) 潔，黃惠勇，李江山，王 超，李路丹，屈婭婷

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208)

肥胖病發(fā)病率逐年上升，預(yù)防和治療肥胖已成為21世紀(jì)全球面臨的最重大的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)［1］。有研究［2］表明：食源性肥胖與胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1，IRS1)上絲/蘇氨酸磷酸化活性增強(qiáng)有關(guān)。針灸作為一種治療單純性肥胖的方法，蘊(yùn)育著極大的科學(xué)內(nèi)涵和實(shí)踐價(jià)值。本研究觀察了針刺足陽(yáng)明經(jīng)穴(四白、天樞、足三里、內(nèi)庭)對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠血脂及下丘腦胰島素受體底物1(IRS1)及其絲氨酸磷酸化(pIRS1-Ser307和pIRS1-Ser636/639水平)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量50～70 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：湘醫(yī)動(dòng)字第20-002號(hào)。

1.2 試 劑

兔抗 IRS1(批號(hào) BF30468)、兔抗 pIRS1-Ser307(批 號(hào) CY30691)、兔 抗 pIRS1-Ser636/639(批 號(hào)JP94837)，均購(gòu)自Cell Signaling Technology;二抗山羊抗兔多克隆IgG抗體(HRP標(biāo)記)，購(gòu)自Invitro-gen，批號(hào)53HS636V;ECL Plus試劑盒，購(gòu)自 Millpore，批號(hào) 893WU906。

1.3 模型的建立

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白對(duì)照組10只，給予普通飼料(由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供);實(shí)驗(yàn)組60只，給予高脂飼料［3］(由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。自由進(jìn)食飲水，室溫21～24℃。每2周稱量體質(zhì)量，記錄并進(jìn)行體質(zhì)量分析。大鼠肥胖判斷標(biāo)準(zhǔn)：凡經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)12周后，SD大鼠的體質(zhì)量超過(guò)普通飼料喂養(yǎng)大鼠體質(zhì)量的20%作為實(shí)驗(yàn)肥胖大鼠。

1.4 動(dòng)物分組與干預(yù)

SD肥胖大鼠模型建立后，取30只肥胖大鼠，將其隨機(jī)分為模型對(duì)照組、針刺足陽(yáng)明經(jīng)穴(針刺組)、針刺非經(jīng)穴組(非經(jīng)穴組)，每組10只。針刺組將清醒大鼠固定于特制的裝置，取單側(cè)四白、天樞、足三里、內(nèi)庭穴(隔天交替針另一側(cè))，局部750 g/L酒精常規(guī)消毒后，針入3～5 mm，接通電針儀，頻率為10 Hz，強(qiáng)度3 mA，以胡須及肢體微動(dòng)為度，時(shí)間15 min。穴位的定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位。非經(jīng)穴組在固定大鼠后選擇四白、天樞、足三里、內(nèi)庭穴旁開非經(jīng)穴點(diǎn)針刺?？瞻讓?duì)照組、模型對(duì)照組行抓取固定，不作任何治療。每天治療1次，治療6 d休息1 d，持續(xù)4周。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 血清生化指標(biāo)

大鼠取血前需過(guò)夜禁食8 h，上午8時(shí)取血，準(zhǔn)確測(cè)量體質(zhì)量(BW)，內(nèi)眥靜脈采血，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)三酰甘油(TG)、總膽固醇(TCH)、極低密度脂蛋白(VLDL)。

1.5.2 蛋白表達(dá)

采用Western blot法［4］。-70℃冰箱里取出大鼠下丘腦組織，用細(xì)胞裂解液裂解，行超聲萃取后測(cè)定總蛋白表達(dá)。分裝后置于-20℃冰箱保持。蛋白經(jīng)分光光度儀定量后在垂直電泳儀(BIO-RAD)上用等量蛋白質(zhì)樣品經(jīng)120 g/L SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移于PVDF膜(Millipore)上(30 V，1 h)。PVDF膜經(jīng)100 g/L脫脂奶粉封閉1h后，用體積分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白(BSA)按1∶1000稀釋一抗(CST，Anti rabbit IRS1、Anti rabbit pIRS1-Ser307、Anti rabbit pIRS1-Ser636/639)4℃孵育過(guò)夜。次日膜經(jīng)1×TBST洗滌3次，每次5 min，再用50 g/L脫脂奶粉按照1∶10 000分別稀釋二抗(Invitrogen，HRP-conjugated Goat anti rabbit polyclone IgG)，室溫孵育1 h，1×TBST充分洗滌后，使用 ECL Plus試劑盒(Millpore)發(fā)光顯影，膠片曝光，掃描定量各信號(hào)條帶的相對(duì)灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量變化對(duì)比

高脂飲食喂養(yǎng)12周后，模型對(duì)照組大鼠體質(zhì)量達(dá)(524.32 ±34.18)g，高于空白對(duì)照組與針刺組(P ＜0.05或 P ＜0.01);但與非經(jīng)穴組對(duì)比，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。針刺組大鼠體質(zhì)量下降，與非經(jīng)穴組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化對(duì)比g，±s

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化對(duì)比g，±s

注：與空白對(duì)照組對(duì)比，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與非經(jīng)穴組對(duì)比，△ P ＜0.05。

組 別 n 治療前 治療后空白對(duì)照組 10 56.12 ±5.18 467.12 ±28.15##△模型對(duì)照組 10 58.64 ±6.85 524.32 ±34.18＊＊針刺組 10 59.22 ±7.25 480.23 ±30.75*#△非經(jīng)穴組 10 55.46 ±4.25 512.45 ±35.25*

2.2 干預(yù)后各組TG、TCH及VLDL對(duì)比

與空白對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組及非經(jīng)穴組TG、TCH、VLDL均升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。針刺組大鼠TG、VLDL下降，與模型對(duì)照組及非經(jīng)穴組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

表2 干預(yù)后各組TG、TCH及VLDL對(duì)比mmol·L-1，±s

表2 干預(yù)后各組TG、TCH及VLDL對(duì)比mmol·L-1，±s

注：與空白對(duì)照組對(duì)比，＊＊ P＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比，##P＜0.01;與非經(jīng)穴組對(duì)比，△△ P＜0.01。

TG TCH VLDL空白對(duì)照組 10 0.69±0.18##△△ 1.82±0.21##△△ 0.23±0.06##△△組 別 動(dòng)物數(shù)模型對(duì)照組 10 1.25±0.34＊＊ 2.29±0.23＊＊ 0.36±0.04＊＊針刺組 10 0.86 ±0.25##△△ 2.11 ±0.21＊＊ 0.22 ±0.06##△△非經(jīng)穴組 10 1.18±0.29＊＊ 2.15±0.22＊＊ 0.35±0.09＊＊

2.3 各組 IRS1蛋白、pIRS1-Ser307和pIRS1-Ser636/639水平對(duì)比

IRS1蛋白表達(dá)由低到高依次為模型對(duì)照組、非經(jīng)穴組、針刺組、空白對(duì)照組。模型對(duì)照組及非經(jīng)穴組的IRS1-Ser307和pIRS1-Ser636/639表達(dá)增高，與空白對(duì)照組及針刺組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

表3 各組IRS1蛋白、pIRS1-Ser307和pIRS1-Ser636/639水平對(duì)比

3 討論

肥胖是指身體內(nèi)所含的脂肪組織超出了維持生理正常功能的比例，是一種常見的代謝癥候群。高脂飼料喂養(yǎng)大鼠是建立肥胖模型最常用的方法，這與人類單純性肥胖類似［5］，也與《素問(wèn)·奇病論》所言“此肥美之所發(fā)也。此人必?cái)?shù)食甘美而多肥也”不謀而合。高脂飲食可誘導(dǎo)肥胖癥，表現(xiàn)為體質(zhì)量增加和血脂代謝的紊亂，并常伴有胰島素和瘦素抵抗［5］。

IRS是經(jīng)典胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路上的關(guān)鍵信號(hào)分子之一，同時(shí)也是反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)的重要靶點(diǎn)。IRS主要包含兩種類型的磷酸化：其一為酪氨酸磷酸化位點(diǎn)的磷酸化及其與PI3K的結(jié)合，這是胰島素刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵信號(hào)反應(yīng)過(guò)程;其二為絲/蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)的磷酸化：IRS1包含70多個(gè)潛在的絲/蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，其磷酸化對(duì)胰島素信號(hào)通路的傳導(dǎo)主要起負(fù)調(diào)節(jié)作用Ser307和Ser636/639位點(diǎn)主要位于IRS1的酪氨酸磷酸化結(jié)合區(qū)域，其磷酸化可以阻礙IRS1與胰島素受體的結(jié)合，從而抑制IRS1的酪氨酸磷酸化，阻斷胰島素信號(hào)通路傳導(dǎo)［2］。研究認(rèn)為：Ser307和Ser636/639位點(diǎn)磷酸化增強(qiáng)與營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩所致肥胖密切相關(guān)［6］。

在針刺減肥的研究中，足陽(yáng)明胃經(jīng)的穴位天樞、足三里、內(nèi)庭是最常用的腧穴［7］。我們前期研究表明，足陽(yáng)明經(jīng)的四白穴與胃腸運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)且兩者傳入信息可以在中樞匯聚［8-9］，它可能在肥胖研究中有著重要的作用。因此，本研究中選擇足陽(yáng)明經(jīng)穴這四個(gè)腧穴作為研究對(duì)象。龔美蓉等［10］的研究表明：針刺足三里、內(nèi)庭和中脘，在減肥的同時(shí)，可顯著上調(diào)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠胰島組織IRS1 mRNA表達(dá)。本研究結(jié)果表明：針刺四白、天樞、足三里、內(nèi)庭可顯著改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖，并可有效降低三酰甘油和極低密度脂蛋白;盡管對(duì)于IRS1蛋白表達(dá)并無(wú)顯著的提高，卻可顯著抑制pIRS1-Ser307和pIRS1-Ser636/639，此值得注意。這提示針刺足陽(yáng)明經(jīng)穴改善肥胖體質(zhì)的落腳點(diǎn)，可能在胰島素受體后信號(hào)傳導(dǎo)通路中的磷酸化環(huán)節(jié)以及反饋調(diào)節(jié)位點(diǎn)。

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