劉子記，曹振木，楊衍

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，海南儋州，571737）

種子是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)科技進(jìn)步的載體。種子質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和優(yōu)良品種的增產(chǎn)潛力，而種子質(zhì)量的好壞在很大程度上取決于種子的純度，開(kāi)展種子純度檢測(cè)對(duì)保證種子質(zhì)量和提高生產(chǎn)效益具有重要意義。生物混雜及機(jī)械混雜是影響雜交種純度的主要原因，作物雜交種純度檢驗(yàn)的常用方法主要包括形態(tài)鑒定、田間鑒定和同工酶電泳技術(shù)鑒定等[1]。種子形態(tài)差異有限，且易受環(huán)境條件影響，因此形態(tài)鑒定準(zhǔn)確性較差；田間鑒定所需時(shí)間較長(zhǎng)，成本較高，表型易受栽培措施和環(huán)境條件的影響，不同的鑒定者對(duì)同一性狀的評(píng)價(jià)也存在一定的差異，不能滿(mǎn)足快速檢測(cè)雜交種純度的需要；同工酶鑒定雖然準(zhǔn)確、可靠、不受外界環(huán)境影響，但多態(tài)性不夠豐富，且有組織和器官特異性[2]。

隨著作物新品種數(shù)量的不斷增加，遺傳基礎(chǔ)日趨狹窄，傳統(tǒng)的鑒定方法不能有效區(qū)分遺傳關(guān)系較近的雜交種[3]，難以滿(mǎn)足作物雜交種純度鑒定在精確度方面的要求。近年來(lái)，隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的問(wèn)世及迅速發(fā)展，使得從基因組水平上檢測(cè)雜交種純度成為可能。分子標(biāo)記技術(shù)能夠從DNA水平上揭示雜交子代與親本間的遺傳差異，不受植株生長(zhǎng)季節(jié)的限制，不受基因表達(dá)、栽培條件和環(huán)境條件的影響，無(wú)器官、組織及發(fā)育特異性，能夠檢測(cè)微小的變異，多態(tài)性豐富，穩(wěn)定性高，可以大大縮短檢驗(yàn)時(shí)間[4]。近年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)在國(guó)內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于作物雜交種純度鑒定。

1 RFLP分子標(biāo)記在鑒定作物雜交種純度中的應(yīng)用

RFLP （Restriction fragment length polymorphism）分子標(biāo)記，即限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，其基本原理是利用限制性?xún)?nèi)切酶酶切基因組DNA，酶切后的DNA分子經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和變性，利用放射性同位素標(biāo)記的探針與膜上的DNA片段雜交，檢測(cè)由堿基的插入、缺失、重排或點(diǎn)突變引起的多態(tài)性，是發(fā)展最早的DNA標(biāo)記技術(shù)。

RFLP標(biāo)記具有穩(wěn)定可靠、結(jié)果準(zhǔn)確、不受植物發(fā)育階段影響等優(yōu)點(diǎn)。Smith等[5]利用RFLP分子標(biāo)記成功鑒定了78個(gè)玉米雜交種品種；Matsuura等[6]研究結(jié)果表明，利用RFLP標(biāo)記可快速檢測(cè)黃瓜雜交種的純度（表1）。但由于RFLP標(biāo)記操作程序繁瑣、成本較高、多態(tài)性檢出率低、對(duì)DNA的需求量大且質(zhì)量要求較高、并且放射性同位素對(duì)操作人員身體有害，此法不適于進(jìn)行大批量雜交種純度鑒定，在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。

2 RAPD分子標(biāo)記在鑒定作物雜交種純度中的應(yīng)用

RAPD（Random amplified polymorphic DNA）標(biāo)記，即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，該技術(shù)建立在PCR基礎(chǔ)上，以基因組DNA為模板，以10個(gè)堿基左右的隨機(jī)寡聚核苷酸序列為引物，檢測(cè)遺傳位點(diǎn)的多態(tài)性，可對(duì)未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、成本低、自動(dòng)化程度高、分辨率高、實(shí)驗(yàn)周期短、靈敏度強(qiáng)、檢測(cè)位點(diǎn)多、DNA用量少等優(yōu)點(diǎn)，能有效檢測(cè)從形態(tài)和生化指標(biāo)上均無(wú)法檢測(cè)到的差異，被廣泛用于雜交種純度鑒定、基因定位和基因克隆等多方面研究。RAPD標(biāo)記被成功應(yīng)用于苦瓜[7]、冬瓜[8]、南瓜[9]和西瓜[10]等瓜類(lèi)作物雜交種純度的鑒定；莫結(jié)勝等[11]利用RAPD標(biāo)記鑒定雜交油葵種子純度，鑒定結(jié)果與大田檢測(cè)結(jié)果基本一致；朱海山等[12]和葛菊芬等[13]研究結(jié)果表明，RAPD標(biāo)記可以用于番茄和辣椒等茄果類(lèi)作物雜交種純度的鑒定；邵景俠等[14]成功利用RAPD標(biāo)記對(duì)雜交小麥西雜一號(hào)進(jìn)行純度鑒定（表1）。

由于RAPD標(biāo)記屬于顯性標(biāo)記，不能有效區(qū)分純合基因型和雜合基因型，另外其穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，易受各種因素的影響，通常將其轉(zhuǎn)化為SCAR（Sequenced characterized amplified regions）標(biāo)記，其原理是將多態(tài)性片段回收、克隆、測(cè)序后，設(shè)計(jì)出較長(zhǎng)的引物進(jìn)行特異擴(kuò)增，可以顯著提高檢測(cè)的穩(wěn)定性和實(shí)用性。陳靈芝等[15]成功將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記，有效地將隴椒5號(hào)辣椒雜交種與母本區(qū)分開(kāi)來(lái)；王飛等[16]建立了檢測(cè)金棚1號(hào)番茄雜交種純度的SCAR標(biāo)記技術(shù)體系，為金棚1號(hào)番茄種子的生產(chǎn)與銷(xiāo)售提供了有效的檢測(cè)方法（表1）。

3 AFLP分子標(biāo)記在鑒定作物雜交種純度中的應(yīng)用

AFLP（Amplified fragment length polymorphism）分子標(biāo)記，即擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性，該技術(shù)利用限制性?xún)?nèi)切酶酶切基因組DNA，將特定的接頭與酶切后的DNA片段連接，根據(jù)接頭與酶切位點(diǎn)的序列設(shè)計(jì)PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)遺傳位點(diǎn)多態(tài)性。

該技術(shù)具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性高、可靠性好、不需要預(yù)先知道基因組序列信息等優(yōu)點(diǎn)。劉杰等[17]試驗(yàn)結(jié)果證明，利用AFLP標(biāo)記檢測(cè)向日葵雜交種純度是可行的；宋順華等[18]成功利用AFLP技術(shù)將90個(gè)大白菜品種區(qū)分開(kāi)來(lái)；王玲平等[19]以瓠瓜雜交種浙蒲2號(hào)及其父、母本為材料，成功建立了利用AFLP分子標(biāo)記進(jìn)行瓠瓜雜交種純度鑒定的技術(shù)體系（表1）。但由于操作繁瑣、對(duì)試驗(yàn)技能要求較高，試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，對(duì)DNA的質(zhì)量要求很高，AFLP技術(shù)難以在種子純度鑒定中獲得廣泛應(yīng)用。

4 SSR分子標(biāo)記在鑒定作物雜交種純度中的應(yīng)用

SSR（Simple sequence repeats）標(biāo)記，即簡(jiǎn)單序列重復(fù)，是一類(lèi)由幾個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，SSR兩側(cè)的序列一般相對(duì)保守，通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)串聯(lián)重復(fù)單位數(shù)目的差異檢測(cè)多態(tài)性。

SSR標(biāo)記具有數(shù)量豐富、在染色體上分布均勻、多態(tài)性高、共顯性遺傳、等位性變異豐富、重復(fù)性好、對(duì)DNA質(zhì)量要求不高且需要量少、操作簡(jiǎn)單、不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點(diǎn)，已在多種農(nóng)作物雜交種純度鑒定中得到應(yīng)用。蘭剛等[2]、王愛(ài)娜等[20]和宋賢勇等[21]分別利用SSR標(biāo)記對(duì)油菜雜交種合油雜2號(hào)、秦優(yōu)33和秦優(yōu)11進(jìn)行純度鑒定，鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果基本一致；高海娜等[22]和苗明軍等[23]成功利用SSR標(biāo)記對(duì)甘藍(lán)雜交種秦甘50和西園4號(hào)進(jìn)行純度鑒定；管志坤等[24]利用SSR標(biāo)記鑒定油綠3號(hào)大白菜品種純度，鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果非常接近；SSR 標(biāo)記廣泛用于西瓜[25]、黃瓜[26，27]、瓠瓜[28]、甜瓜[29，30]雜交種純度鑒定，初步建立了利用SSR分子標(biāo)記鑒定瓜類(lèi)作物雜交種純度的技術(shù)體系；大量研究表明，SSR標(biāo)記可應(yīng)用于玉米雜交種鄭單 958[31]、黔單 16[32]、寧單 11[33]純度鑒定，與田間鑒定相比，準(zhǔn)確性更高，速度更快，能大大提高檢測(cè)效率；王利英等[34]和白占兵等[35]研究結(jié)果表明，利用SSR分子標(biāo)記檢測(cè)茄科作物茄子和辣椒雜交種純度可行且高效，具有一定的理論和應(yīng)用價(jià)值；陳志偉等[36]研究結(jié)果證明，利用SSR分子標(biāo)記可以快速、有效地鑒定大麥雜交種純度；田蕾等[37]利用多對(duì)SSR標(biāo)記鑒定大豆雜交種純度，檢測(cè)結(jié)果完全一致；趙振卿等[38]利用SSR標(biāo)記對(duì)花椰菜雜交種浙801純度進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致（表1）。

開(kāi)發(fā)基因組SSR標(biāo)記成本較高、步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。EST-SSR （expressed sequence tag-simple sequence repeat）標(biāo)記是根據(jù)EST序列中的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列開(kāi)發(fā)的一種標(biāo)記類(lèi)型，具有SSR標(biāo)記和EST技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，并且降低了開(kāi)發(fā)成本、節(jié)省了開(kāi)發(fā)時(shí)間、提高了開(kāi)發(fā)效率，另外，EST序列高度的保守性使得EST-SSR標(biāo)記在種與品種間有較好的通

用性，顯著提高了其利用價(jià)值。近年來(lái)，隨著基因組測(cè)序的發(fā)展，豐富的EST序列資源為EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了有利途徑。盧銳等[39]篩選出2對(duì)EST-SSR標(biāo)記，可用于黃瓜雜交種純度的鑒定；張庶等[40]研究結(jié)果表明，EST-SSR標(biāo)記可以快速、準(zhǔn)確地鑒別大白菜雜交種純度；張國(guó)裕等[41]利用ESTSSR標(biāo)記對(duì)南瓜屬作物雜交種進(jìn)行純度檢測(cè)，與田間鑒定結(jié)果相符；匡猛等[42]試驗(yàn)結(jié)果證明，利用EST-SSR標(biāo)記鑒定棉花雜交種純度與田間鑒定結(jié)果的相關(guān)性顯著高于基因組SSR標(biāo)記；趙新等[43]篩選得到1對(duì)共顯性的EST-SSR標(biāo)記，可用于花椰菜雜交種純度的鑒定，鑒定結(jié)果與田間形態(tài)鑒定結(jié)果較為一致。

表1 分子標(biāo)記技術(shù)在作物雜交種純度鑒定中的應(yīng)用

5 SRAP分子標(biāo)記在鑒定作物雜交種純度中的應(yīng)用

SRAP （Sequence-related amplified polymorphism）標(biāo)記，即相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性，該技術(shù)通過(guò)獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對(duì)基因的開(kāi)放閱讀框區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物與外顯子區(qū)域特異結(jié)合，下游引物與啟動(dòng)子或內(nèi)含子區(qū)域結(jié)合，檢測(cè)不同個(gè)體間內(nèi)含子、啟動(dòng)子及間隔區(qū)序列長(zhǎng)度不同產(chǎn)生的多態(tài)性。

該標(biāo)記技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、高共顯性、穩(wěn)定性強(qiáng)、分辨率較高、重復(fù)性好、成本低、在基因組中分布均勻等特點(diǎn)，在作物雜交種純度鑒定中有著廣泛的應(yīng)用。扈新民等[44]利用SRAP分子標(biāo)記對(duì)辣椒雜交種航椒4號(hào)進(jìn)行純度檢測(cè)，與田間鑒定結(jié)果十分接近。鐘開(kāi)勤等[45]研究結(jié)果證明，SRAP標(biāo)記可以用于花椰菜雜交種純度鑒定；張永平等[46]和熊麗曼等[47]成功利用SRAP標(biāo)記對(duì)甜瓜雜交種進(jìn)行純度檢測(cè)；黃建都等[48]研究結(jié)果表明，SRAP標(biāo)記技術(shù)可用于甘藍(lán)雜交種夏華2號(hào)純度鑒定，鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致；蓋樹(shù)鵬等[49]試驗(yàn)結(jié)果證明，與SSR標(biāo)記相比，利用SRAP標(biāo)記檢測(cè)雜交種純度更接近田間鑒定結(jié)果（表1）。

6 SNP和InDel分子標(biāo)記在鑒定作物雜交種純度中的應(yīng)用

隨著作物基因組測(cè)序工作的進(jìn)展，新型分子標(biāo)記 InDel （Insertion-deletion） 和 SNP （Single nucleotide polymorphism）的開(kāi)發(fā)越來(lái)越容易，為利用新型分子標(biāo)記進(jìn)行作物雜交種純度鑒定創(chuàng)造了有利條件。InDel標(biāo)記，即插入缺失標(biāo)記，指由核苷酸水平上堿基的插入或缺失引起的多態(tài)性。SNP標(biāo)記，即單核苷酸多態(tài)性，指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。

InDel和SNP標(biāo)記具有數(shù)量豐富、穩(wěn)定性好、高通量和高度自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。蘭青闊等[50]利用InDel標(biāo)記檢測(cè)黃瓜津優(yōu)38雜交種純度，與SSR標(biāo)記鑒定結(jié)果基本一致；張?bào)w付等[1]成功利用InDel標(biāo)記對(duì)6個(gè)玉米雜交種進(jìn)行了純度鑒定；蘭青闊等[51]基于SNP標(biāo)記檢測(cè)黃瓜雜交種優(yōu)一種子純度，鑒定結(jié)果與SSR標(biāo)記鑒定結(jié)果相符。

7 展望

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，作物雜交種純度鑒定技術(shù)也由主要依賴(lài)田間鑒定進(jìn)入分子鑒定水平，分子標(biāo)記技術(shù)因其快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、節(jié)省大量人力和財(cái)力以及不受環(huán)境因素影響等特點(diǎn)，逐步成為作物雜交種純度檢測(cè)的首選工具，為雜交種純度鑒定提供了一種更為有效和可靠的方法[52]。不同的分子標(biāo)記技術(shù)具有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中，要根據(jù)研究對(duì)象充分發(fā)揮標(biāo)記技術(shù)優(yōu)勢(shì)，這樣才能更準(zhǔn)確、快速地達(dá)到鑒定目的。

在作物雜交種制種過(guò)程中，由于隔離不嚴(yán)導(dǎo)致的生物混雜是不可避免的現(xiàn)象，因此，利用單對(duì)標(biāo)記鑒定雜交種純度具有一定的局限性。為確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，應(yīng)同時(shí)對(duì)供試樣品的多個(gè)遺傳位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析。選取位于染色體不同區(qū)域的標(biāo)記組合起來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，不僅可以區(qū)分親本自交種，還能有效檢測(cè)出其他來(lái)源花粉所導(dǎo)致的生物性混雜。

分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展將會(huì)導(dǎo)致新的分子標(biāo)記不斷出現(xiàn)，現(xiàn)有的技術(shù)也會(huì)不斷得到完善。將分子標(biāo)記技術(shù)與傳統(tǒng)育種方法相結(jié)合，可快速、準(zhǔn)確地對(duì)雜交種純度進(jìn)行早期檢測(cè)，對(duì)于保證種子質(zhì)量和優(yōu)良品種推廣具有重要意義。

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