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        葫蘆科蔬菜游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展

        2013-12-08 05:05:52閔子揚(yáng)童龍李玲王志偉唐炎英肖璐李涵孫小武
        長江蔬菜 2013年12期
        關(guān)鍵詞:葫蘆科花藥培養(yǎng)胚狀體

        閔子揚(yáng) ,童龍 ,李玲 ,王志偉 ,唐炎英 ,肖璐 ,李涵 ,孫小武 ,3

        (1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),長沙,410128;2.湖南省農(nóng)科院;3.湖南省瓜類研究所)

        葫蘆科(Cucurbitaceae)植物包括118個(gè)屬共825個(gè)種,廣泛分布于亞熱帶和熱帶地區(qū)。中國分布約有29個(gè)屬,142個(gè)種,其中大部分是人們喜愛的瓜類蔬菜作物如西瓜(Citrullus lanatus)、黃瓜(Cucumis sativus.L.)、 苦瓜 (Momordica charantia L.)、 南 瓜(Cucurbita pepo L.)等。葫蘆科是世界上最重要的食用植物科之一,僅次于禾本科、豆科和茄科,在人們生活中具有重要的作用[1]。

        葫蘆科植物在常規(guī)育種過程中存在育種年限長、難度大、遺傳性狀不穩(wěn)定等情況,嚴(yán)重制約了葫蘆科植物在生產(chǎn)上的進(jìn)一步利用。近年來,游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的不斷成熟,為這一問題的解決帶來了曙光。游離小孢子技術(shù)研究于20世紀(jì)70年代初開始,1982年在蕓薹屬作物上首次獲得成功[2]。小孢子是直接從花藥或花蕾中游離出來的天然分散的細(xì)胞,具有單倍體和單細(xì)胞的特性。游離小孢子培養(yǎng)是指直接培養(yǎng)植物小孢子,誘導(dǎo)小孢子胚胎發(fā)生和植株再生,經(jīng)染色體加倍后直接獲得遺傳上純合的雙單倍體株系(DH),從而大大簡化常規(guī)育種中自交純合程序,縮短育種年限,加速蔬菜新品種選育。近年來,游離小孢子培養(yǎng)已經(jīng)在大白菜、胡蘿卜、青花菜、辣椒、茄子、小麥、大麥等作物上獲得了再生的單倍體植株,但是在葫蘆科植物上的研究還相對較少,僅在黃瓜[3]和西瓜[4]上獲得了胚狀體或再生植株。為了總結(jié)前人在葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)上的研究成果,為以后的相關(guān)研究提供指導(dǎo),對葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)的影響因素進(jìn)行了綜述。

        1 供體植株對小孢子胚胎發(fā)生的影響

        供體植株對小孢子胚胎發(fā)生的影響主要體現(xiàn)在植株的基因型、植株生長狀況和生長環(huán)境、小孢子發(fā)育時(shí)期等方面。

        1.1 基因型

        基因型對小孢子培養(yǎng)中胚狀體的發(fā)生具有決定性作用,不同基因型材料在相同的培養(yǎng)條件下成胚率有很大差異。詹艷等[3]對10份黃瓜的供試材料進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),只有4份試材獲得了胚狀體,其中成胚率最高的是“7447”,為每皿31.2個(gè),最低的是“康德”,為每皿1.5個(gè)。剩余的6份材料中有些游離小孢子出現(xiàn)膨大,有些已啟動分裂,但均未能繼續(xù)分裂形成胚狀體。李娟等[4]在西瓜上的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),野生種和栽培種的成胚率有顯著差別,前者要高于后者。緱艷霞[5]和董艷榮[6]分別在西瓜和甜瓜花藥培養(yǎng)試驗(yàn)中得出F1代植株的愈傷組織誘導(dǎo)率明顯大于親本,表現(xiàn)雜種優(yōu)勢,說明小孢子的基因型至少是決定培養(yǎng)能力的因素。

        1.2 植株的生長狀況和環(huán)境

        供體植株的生長狀況和生長環(huán)境對小孢子的胚胎發(fā)生也有重要影響。有研究表明,如果在小孢子的形成過程中遇到連續(xù)的陰雨天氣或者是嚴(yán)重的光照不足,小孢子的活力就會嚴(yán)重降低以至于影響小孢子的成胚率。張鳳蘭等[7]利用人工氣候室研究了光照和溫度對小孢子胚胎發(fā)生的影響,結(jié)果表明,光照時(shí)數(shù)為14 h、溫度為20℃時(shí)最利于小孢子胚胎的發(fā)生,產(chǎn)胚量最高。曹鳴慶等[8]報(bào)道生長在日照14~16 h、溫度15~20℃條件下的植株在小孢子培養(yǎng)的過程中成胚率最高。供體植株的栽培季節(jié)對獲得較高活力的小孢子也非常重要,謝淼等[9]利用取自不同季節(jié)的黃瓜花藥進(jìn)行小孢子培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于季節(jié)的不同,所接種黃瓜花藥的誘導(dǎo)率不同,秋季的誘導(dǎo)率低于春季。另外,供體植株的營養(yǎng)狀況也是影響小孢子胚胎發(fā)生的重要因素,供體植株栽培密度過大則小孢子的成胚率降低[10]。

        1.3 小孢子的發(fā)育時(shí)期

        小孢子的發(fā)育時(shí)期是影響小孢子培養(yǎng)效果的重要因素[11]?;ǚ坌℃咦影l(fā)育可分為四分體時(shí)期、單核期、雙核期和三核期,單核期又可細(xì)分為單核早期、單核中期和單核晚期。因細(xì)胞具有全能性,理論上所有時(shí)期的小孢子都能發(fā)育成為一個(gè)完整的植株,但是實(shí)際上只有那些處于特定時(shí)期的小孢子才能在離體條件下從配子體發(fā)育途徑經(jīng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)殒咦芋w發(fā)育途徑,最終形成胚狀體。詹艷[12]探究了3份黃瓜材料不同小孢子發(fā)育時(shí)期對小孢子成胚率的影響,結(jié)果表明,只有單核靠邊期的小孢子才能誘導(dǎo)成胚。董艷榮[6]關(guān)于甜瓜的研究表明,花藥培養(yǎng)的最佳時(shí)期是單核靠邊期到雙核期,李娟[4]在西瓜中也有類似報(bào)道。目前的研究結(jié)果表明,小孢子處于單核靠邊期時(shí)誘導(dǎo)成胚率都是最高的。

        小孢子的發(fā)育階段跟花蕾的外部形態(tài)有密切關(guān)系,通過對花蕾外部形態(tài)如長度、顏色的觀察可以大致確定小孢子所處的發(fā)育階段。葫蘆科不同植物小孢子培養(yǎng)的最適花蕾長度見表1,但是Turlingn[13]在進(jìn)行油菜花藥培養(yǎng)時(shí)曾指出,雖然花蕾大小是判斷小孢子發(fā)育階段的可靠指標(biāo),但它也隨著供體植株的基因型、生長條件、發(fā)育階段和花序等的變化而變化,所以花蕾長度只能作小孢子發(fā)育時(shí)期的參考指標(biāo),具體發(fā)育時(shí)期還要進(jìn)一步鑒定。

        表1 一些葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)的最適花蕾長度

        2 培養(yǎng)基及其成分對小孢子胚胎發(fā)生的影響

        培養(yǎng)基的種類和成分對小孢子胚胎發(fā)生的影響顯著,主要因素為基本培養(yǎng)基的種類、碳源物質(zhì)種類、培養(yǎng)基中添加的激素種類和濃度以及是否添加活性炭。

        2.1 基本培養(yǎng)基的種類

        在大多數(shù)葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)中所用的基本培養(yǎng)基都是MS,但是也有一些其他的報(bào)道。蘇華等[17]研究了B5,MS,Nitsch,N6四種基本培養(yǎng)基對黃瓜花藥培養(yǎng)的影響,結(jié)果表明,基本培養(yǎng)基中MS對津春3號的愈傷組織誘導(dǎo)率顯著低于其他培養(yǎng)基。詹艷等[3]指出在黃瓜游離小孢子培養(yǎng)中,NLN和B5作為基本培養(yǎng)基時(shí)獲得的胚狀體產(chǎn)量差異不顯著,但NLN更有利于球形胚進(jìn)一步發(fā)育形成子葉形胚。董艷榮[6]將MS培養(yǎng)基中的Fe-EDTA、Mg2SO4·7H2O和VB1增加一倍得到改良的MS培養(yǎng)基MSKI,用作甜瓜的小孢子培養(yǎng)取得了良好的效果。

        2.2 碳源

        葫蘆科蔬菜游離小孢子培養(yǎng)中使用的碳源和滲透調(diào)節(jié)劑以蔗糖為主,其類型和濃度對小孢子存活以及胚狀體的形成具有很大的影響,不同作物的最適蔗糖濃度有所差別,但以13%最為有利[3,18]。在葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)時(shí)也有一些使用麥芽糖的報(bào)道,但是關(guān)于這兩種碳源到底哪一種更有利于小孢子的培養(yǎng)目前還未見報(bào)道,僅陳振光[19]、何艷等[20]在苦瓜的花藥培養(yǎng)中得出蔗糖作為碳源比麥芽糖更有利的結(jié)論。在十字花科蔬菜的小孢子培養(yǎng)中有在培養(yǎng)初期使用較高濃度蔗糖(17%)以保持小孢子的活力,一定時(shí)間(1~4 d)后加液稀釋或更換培養(yǎng)基降低蔗糖濃度到10%~14%來促進(jìn)小孢子分裂可以顯著提高胚產(chǎn)量的報(bào)道[21],但這種方法在葫蘆科蔬菜上還未見報(bào)道,有待進(jìn)一步研究。

        2.3 激素

        在葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)過程中,激素的種類和配比對胚狀體的形成起著至關(guān)重要的作用。經(jīng)常使用的激素有生長素和細(xì)胞分裂素兩大類,前者包括 2,4-D、IAA、NAA 等, 后者包括 6-BA、ZT、KT等。不同植物激素在培養(yǎng)中的作用不同,生長素可以誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和根的分化,而細(xì)胞分裂素則能促使細(xì)胞分裂和胚狀體的形成。蘇華等[17]在關(guān)于黃瓜花藥培養(yǎng)的研究中指出,對愈傷組織誘導(dǎo)率影響最大的是2,4-D。緱艷霞[5]在西瓜花藥培養(yǎng)中同樣發(fā)現(xiàn),2,4-D在西瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用,但其質(zhì)量濃度不宜超過0.5 mg/L。但也有學(xué)者指出在瓜類花藥愈傷組織的形成過程中,6-BA是一個(gè)關(guān)鍵因素。大量瓜類花藥培養(yǎng)試驗(yàn)表明,在基本培養(yǎng)基中添加6-BA能顯著提高愈傷組織的誘導(dǎo)率,配合2,4-D 和 KT使用效果更好[22]。詹艷[12]在關(guān)于黃瓜小孢子培養(yǎng)的試驗(yàn)中把2,4-D和6-BA配合使用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)長春密刺、7447和康德三個(gè)黃瓜品種在2,4-D 0.5 mg/mL+6-BA 0.2 mg/mL的培養(yǎng)基上都誘導(dǎo)了胚胎的發(fā)生,長春密刺在無外源激素的培養(yǎng)基和濃度較高(2,4-D 1 mg/mL+6-BA 0.5 mg/mL 和 2,4-D 2 mg/mL+6-BA 1 mg/mL)的培養(yǎng)基上雖有胚狀體產(chǎn)生但產(chǎn)量顯著降低。此試驗(yàn)說明外源激素是小孢子胚胎發(fā)生的必要條件,但是所需濃度較低。

        2.4 活性炭

        關(guān)于活性炭在小孢子培養(yǎng)中的作用,Weatherhead和Hensaw指出活性炭能吸附培養(yǎng)基中對小孢子生長發(fā)育有一定抑制作用的5-羥甲基糠醛、酚類物質(zhì)以及雜質(zhì)等,從而提高出胚率[23]。在十字花科、茄科以及禾本科的小孢子培養(yǎng)中使用活性炭提高小孢子出胚率的報(bào)道已經(jīng)很多,但是也有人指出活性炭在吸附培養(yǎng)基中有害物質(zhì)的同時(shí)也會吸附有益物質(zhì)如NAA、6-BA等,所以不同試驗(yàn)材料效果可能有顯著差異。緱艷霞[5]和喻財(cái)鈴[24]分別在西瓜和絲瓜的花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)加入活性炭出胚效果差,有抑制愈傷組織形成的作用。

        3 培養(yǎng)技術(shù)對小孢子胚胎發(fā)生的影響

        小孢子的培養(yǎng)技術(shù)主要包括花蕾的低溫預(yù)處理和游離小孢子的高溫預(yù)培養(yǎng),其目的主要是從形態(tài)上改變其極性分布,從生理代謝上改變其生理狀態(tài),從而改變小孢子的發(fā)育途徑使其由配子體發(fā)育途徑向孢子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)變,對培養(yǎng)中能否出現(xiàn)胚狀體至關(guān)重要。

        3.1 花蕾的預(yù)處理

        在游離小孢子培養(yǎng)中預(yù)處理的方法很多,如低溫、高溫、熱激、離心以及甘露醇處理等,在葫蘆科中一般使用的預(yù)處理方法是低溫預(yù)處理,處理溫度為4℃。針對不同的作物處理的時(shí)間有所差別,魏瑛[25]指出,西瓜花藥在4℃處理72 h效果最佳;Ashok Kumar[26]等將黃瓜花蕾在4℃和32℃下分別處理1~10 d。結(jié)果表明,在4℃條件下處理2 d的效果最佳;董艷榮[6]的研究結(jié)果表明,甜瓜花藥在4℃條件下處理36 h效果最好;Metwally等[27]指出,南瓜在4℃的最佳預(yù)處理時(shí)間是4 d。但是也有報(bào)道指出,苦瓜愈傷組織的誘導(dǎo)率隨著在4℃預(yù)處理時(shí)間的延長而降低,預(yù)處理天數(shù)達(dá)到4 d時(shí),愈傷組織的誘導(dǎo)率大幅降低[28]。

        3.2 游離小孢子的預(yù)培養(yǎng)

        游離小孢子在進(jìn)行正常溫度(25~28℃)培養(yǎng)之前首先對其進(jìn)行一段時(shí)間的高溫預(yù)培養(yǎng)是很有必要的,這在十字花科小孢子培養(yǎng)中已經(jīng)得到證實(shí)。高溫預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間一般為24~48 h,處理溫度因植物種類不同而稍有差異(30~36℃)。有報(bào)道指出,與處于25℃恒溫條件下培養(yǎng)的小孢子相比,經(jīng)高溫預(yù)培養(yǎng)的小孢子在培養(yǎng)前3 d活力會有所降低,但是從第4天開始小孢子的活力顯著高于對照[29]。雖然高溫預(yù)處理在十字花科蔬菜游離小孢子培養(yǎng)中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用,并且取得了很好的效果,但在葫蘆科蔬菜作物僅有緱艷霞[5]在西瓜的花藥培養(yǎng)中把花藥先在30℃條件下培養(yǎng)72 h然后轉(zhuǎn)到25℃條件下培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)愈傷組織誘導(dǎo)率顯著提高。

        3.3 接種密度對成胚率的影響

        接種密度與成胚率表現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系,接種密度過大,小孢子在培養(yǎng)基中競爭養(yǎng)分和空間,不利于小孢子的生長;密度過小促進(jìn)物質(zhì)無法形成,也不利于愈傷組織的形成。Duijs等[30]關(guān)于小孢子密度對培養(yǎng)效果的研究表明,當(dāng)小孢子密度在2×104~4×104個(gè)/mL時(shí)最有利于胚狀體的形成。緱艷霞[5]在西瓜花藥培養(yǎng)中指出,通常在直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中接種4個(gè)花蕾的20枚花藥最為合適。

        4 存在問題與進(jìn)一步研究方向

        雖然小孢子培養(yǎng)在育種及生物技術(shù)的運(yùn)用等方面用處很大,但是關(guān)于小孢子培養(yǎng)技術(shù)的一些機(jī)制目前還不是很清楚,只是在十字花科、茄科及禾本科上得到了實(shí)際應(yīng)用,在葫蘆科蔬菜上目前還停留在實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)階段。存在的主要問題是小孢子無法啟動萌發(fā)或者是成胚率太低、不同物種或不同基因型間差異較大、形成的愈傷組織或者是胚狀體無法進(jìn)一步發(fā)育成為單倍體植株。在以后的研究中我們要從碳源、生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度、活性炭的應(yīng)用、預(yù)培養(yǎng)的溫度以及時(shí)間幾個(gè)方面入手,爭取早日建立成熟的葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)的植株再生體系,從而使小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種以及其他生物技術(shù)的應(yīng)用中發(fā)揮積極的作用。

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