劉育華 ，李德超 ，駱海波 ，賀從安 ，張小康 ，熊秋芳 ，張貴生 ，李世升

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，430345；2.武漢市蔬菜科學(xué)研究所）

蘿卜作為重要的蔬菜作物對(duì)我國經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展有著不可替代的作用。蘿卜雄性不育系在蘿卜種質(zhì)優(yōu)化及蘿卜種子生產(chǎn)過程中貢獻(xiàn)巨大[1，2]。蘿卜的雄性不育有兩大類型：細(xì)胞核雄性不育和核-質(zhì)互作雄性不育。細(xì)胞核雄性不育只能獲得不育株率為50%的雄性不育兩用系，故其應(yīng)用受到極大限制。武漢市蔬菜科學(xué)研究所十字花科研究室在以張雪清為首的老專家?guī)ьI(lǐng)下，先后育成系列蘿卜不育系20多套，并利用雜交手段，成功育成春夏紅皮蘿卜（春紅一號(hào)）、春夏白皮蘿卜（春白一號(hào)、春白二號(hào)、春雪）、夏秋白皮蘿卜（夏抗40天）、夏秋紅皮蘿卜（雙紅一號(hào)、紅寶）、早秋白皮蘿卜 （中秋白、60早生）、秋冬蘿卜（三白蘿卜、武青一號(hào)、武雜一號(hào)、武雜三號(hào)蘿卜）、冬春蘿卜（四月白、春雪）、加工蘿卜（武漬一號(hào)）等品種。自這些品種選育至今，已在我國大面積推廣，種植面積超過2萬hm2。隨著對(duì)蘿卜發(fā)育規(guī)律研究的不斷加強(qiáng)和逐步深入[3～8]，蘿卜雄性不育在細(xì)胞發(fā)育形態(tài)、生理生化及分子調(diào)控水平方面 都 取 得 了 重 大 進(jìn) 展[3，4，6]，但 由 于 蘿 卜 雄 性 不 育 遺傳機(jī)制的復(fù)雜性及試驗(yàn)材料的差異性，研究結(jié)果不完全一致。為加強(qiáng)對(duì)原有品種的更新及開發(fā)力度，以早秋蘿卜不育系12-A及其對(duì)應(yīng)保持系為材料，從器官形態(tài)學(xué)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)水平對(duì)小孢子敗育的時(shí)期和原因進(jìn)行分析，試圖為揭示該品種蘿卜的雄性不育機(jī)理提供思路和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為早秋蘿卜不育系12-A及其保持系12-B，種植于武漢市蔬菜科學(xué)研究所武湖基地。按常規(guī)方法對(duì)上述蘿卜品種進(jìn)行栽培和管理。

1.2 試驗(yàn)方法

①花藥組織切片 a.固定與脫水。將分選好的花藥長度分別為1，2，3，4 mm的花蕾放入固定液（4%多聚甲醛，0.1%TritonX-100，1xPBS，pH 值7.4）中4℃固定過夜后，用 1xPBS（pH 值 7.4）清洗 3次，每次10 min。然后用體積分?jǐn)?shù)分別為10%，30%，50%，75%，95%的乙醇依次脫水至100%乙醇，每級(jí)1 h。最后更換2次無水乙醇，各處理1 h。

b.浸蠟。將脫好水的材料放入Steedman'sWax與無水乙醇（1∶1）混合液中37℃處理過夜。次日早上，棄去上述混合液，換成純的Steedman'sWax，37℃滲透1 h。更換新的蠟，并和材料一起轉(zhuǎn)入錫箔紙盒中室溫凝固1 h，隨即放入4℃冰箱進(jìn)一步凝固。

c.切片。由于Steedman'sWax熔點(diǎn)僅為37℃，而在23℃以上會(huì)變得很軟，所以整個(gè)操作過程需要在23℃以下進(jìn)行，否則不利于切片。根據(jù)材料的大小將包埋好的蠟塊切成小塊，并用熔化的蠟將其粘在木塊上 （根據(jù)所要切片的方向擺放），放入冰箱的冷藏室中降溫以保持蠟的硬度。用單面刀片將固定在木塊上的小蠟塊修成梯形。將木塊固定在切片機(jī)上，調(diào)整方向至切面與切片刀的刀口平行，且要保證切面的下邊緣與刀口也是平行的，然后進(jìn)行厚度為10μm的連續(xù)切片。將切好的蠟帶放在預(yù)先加有去離子水的玻片（玻片需預(yù)先以多聚賴氨酸包被好）上，待其充分伸展后吸干大部分水。貼片室溫過夜即可。

d.脫蠟及封片觀察。將貼好片的載玻片放入盛有無水乙醇的染色缸中脫蠟10 min，并重復(fù)該步驟一次。然后經(jīng)過梯度乙醇處理，復(fù)水到去離子水中，并用Hoyer's Solution封片。

②花藥形態(tài)及切片顯微觀察 利用SCX-12 Olympus體式熒光顯微鏡觀察花藥外形,Q-imaging CCD取圖；利用Leica觀察切片結(jié)果，Cooled-CCD取圖。

③圖像處理 圖像經(jīng)由平板掃描儀、照相機(jī)或者各種科研圖像采集儀器配套程序獲得，然后都在Photoshop CS2或Image J軟件中進(jìn)行調(diào)整，最后在CorelDraw X4軟件中拼成圖版。

圖1 蘿卜母本不育系及保持系花藥形態(tài)

2 結(jié)果與分析

2.1 不育系和保持系蘿卜花藥形態(tài)比較

花器官形態(tài)一直以來都是廣大育種工作者在不育系選育過程中的重要標(biāo)準(zhǔn)，尤其是花藥的發(fā)育形態(tài)，因?yàn)槠浜脡氖遣挥蒂|(zhì)量高低的關(guān)鍵因素。通過連續(xù)追蹤觀察12-A不育系及其保持系的早期花蕾及后期盛花形態(tài)，初步比較了二者的形態(tài)差異。

從外形上講，不育系和保持系早期花蕾發(fā)育一致，形態(tài)正常；進(jìn)一步對(duì)盛花（花瓣白色已顯露即將開放，但還沒張開）外形的觀察發(fā)現(xiàn)，12-A不育系花藥明顯折皺、卷曲、褐化且花粉缺失（圖1C、F）。由于花粉的缺失，12-A不育系的雄花最終是完全敗育的。12-A不育系正常花藥形態(tài)的喪失導(dǎo)致花粉不能正常形成，外部形態(tài)觀察只能讓我們了解到花藥形態(tài)的發(fā)育情況，而且只是盛花時(shí)期花藥外露后的形態(tài)，早期花形態(tài)比較也沒有發(fā)現(xiàn)有關(guān)不育的端倪。因此，若要挖掘不育系形成過程的發(fā)育生物學(xué)機(jī)理，必須進(jìn)一步在細(xì)胞學(xué)水平上深入觀察。

圖2 不育系和保持系花藥細(xì)胞結(jié)構(gòu)

2.2 花粉發(fā)育過程中的比較觀察

為了進(jìn)一步研究蘿卜12-A雄性不育系中花藥敗育及花粉缺失的原因，對(duì)早期花藥進(jìn)行了切片觀察，希望通過對(duì)其內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)的了解，在細(xì)胞水平上尋找到花粉敗育的原因。

以花藥長度為參考標(biāo)準(zhǔn)，取長2，3mm的花藥做切片觀察。圖2A，B顯示的分別是12-A保持系及不育系的早期花藥（花藥長2 mm）切片結(jié)果，結(jié)果顯示兩者在花藥早期發(fā)育過程中藥室及花粉早期形態(tài)均正常；圖2C，D顯示的分別是12-A保持系及不育系的早期花藥（花藥長3 mm）切片結(jié)果，結(jié)果表明此時(shí)不育系中花藥藥室結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，通過放大圖（圖2E和F）可以知道，此時(shí)正處于四分體時(shí)期。對(duì)比結(jié)果表明，不育系花藥敗育是在花粉四分體時(shí)期左右藥室壁結(jié)構(gòu)崩解所致。

綜合以上結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，12-A不育系及保持系的花粉都在正常發(fā)育中，只是由于不育系中花藥藥室壁結(jié)構(gòu)在花粉四分體時(shí)期開始崩解導(dǎo)致最終花粉不成熟而完全敗育。花藥藥室壁分內(nèi)壁、中壁及外壁，到底是哪些結(jié)構(gòu)崩解還不得而知。王建波通過電鏡切片觀察蘿卜不育系花藥發(fā)育情況，認(rèn)為蘿卜805不育系花粉出現(xiàn)敗育是由于藥室壁中層的絨氈層異常所致。因此12-A不育系花藥敗育原因是否因藥室壁中層的絨氈層所致[3]，還需要進(jìn)一步研究才能確認(rèn)，但目前可以肯定的是在花粉四分體時(shí)期便開始出現(xiàn)敗育，表明12-A不育系中敗育花粉在四分體時(shí)期開始停止發(fā)育，導(dǎo)致最終花粉完全敗育。

3 結(jié)論

有研究者發(fā)現(xiàn)蘿卜不育系中異常花藥的出現(xiàn)與不育花蕾中淀粉酶活性及總糖、可溶性糖、生長素、淀粉、可溶性蛋白和游離脯氨酸的含量降低有關(guān)[1]。法國學(xué)者發(fā)現(xiàn)蘿卜Ogura雄性不育由位于細(xì)胞質(zhì)線粒體中的orf138和 orfB（atp8）控制，并對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行了功能研究，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)存在著 3個(gè)基因 PPR-A，PPR-B和PPR-C可以抑制ORF138在線粒體內(nèi)的聚集從而完成育性恢復(fù)[4]。綜合試驗(yàn)結(jié)果表明，蘿卜不育系12-A中花粉在四分體時(shí)期開始出現(xiàn)異常，此異常情況是由不育系中花藥藥室壁結(jié)構(gòu)崩解造成。

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