陶 莉，陳 熙，張 程，何 薇，任曉非，許建明，徐德祥

肝臟暴露于各種有害因素可引起急性肝損傷，長期作用可導(dǎo)致?lián)p傷不能完全修復(fù)，發(fā)生代償性修復(fù)的結(jié)果，即形成肝纖維化，并可進一步發(fā)展成肝硬化甚至肝癌，嚴重危害機體健康［1］。目前認為肝纖維化形成機制主要是由于肝臟在急性損傷后引起炎性反應(yīng)，長期刺激激活肝臟星形細胞轉(zhuǎn)化成肝臟成纖維細胞，膠原合成增加，形成肝纖維化［2］，但前期急性肝損傷的發(fā)生機制尚未完全闡明。四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)是一種公認的肝毒物，其引起的化學(xué)性肝損傷動物模型常用于研究急、慢性肝損傷分子機制［3］。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是機體對外來刺激產(chǎn)生的應(yīng)激性反應(yīng)，當外來因素引起機體功能紊亂時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)出現(xiàn)未折疊或錯誤折疊蛋白的聚集和鈣平衡紊亂，誘發(fā)ERS發(fā)生。ERS可以降低胞內(nèi)未折疊蛋白的濃度并阻止其凝集而發(fā)揮保護作用，但如刺激過強或過久，這些反應(yīng)不足以恢復(fù)和維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，就會發(fā)生細胞和組織的損傷。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，ERS在細胞死亡、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)蓄積及氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮重要作用［4-6］。已有研究證實，CCl4致急性肝損傷過程中存在肝臟細胞凋亡、壞死、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等效應(yīng)［7］。本文擬探討ERS在CCl4致小鼠急性肝損傷中的作用及部分機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 CCl4購于汕頭市西隴化工廠有限公司(批號:0811152);丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號:20121103);抗小鼠的GRP78多克隆抗體購于Cell Signal公司(批號:3177);p-JNK(批號:6254)和CHOP多克隆抗體(批號:2895)均購于Santa Cruz公司;Caspase-12多克隆抗體購于Millipore公司(批號:3612);p-IRE1α多克隆抗體(批號:16927)和ECL試劑盒(批號:174573)均購于Thermo Fisher Scientific公司;TUNEL試劑盒購于Promega公司(批號:0000011851);SP免疫組化試劑盒購于北京中山金橋生物公司(批號:13152);DAB購于Sigma公司;其他試劑均購于Sigma公司。

1.2 動物分組與給藥 ♂ ICR小鼠(6-8周齡，28-30 g，清潔級)購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。實驗前，在自由飲食、飲水，維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜節(jié)律，溫度20℃ -25℃，相對濕度(50±5)%的環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，各組小鼠均自由進食標準飼料。24只♂ICR小鼠隨機分為CCl4處理不同時點組(0、2、6、12、24 和 72 h)，每組 4 只。所有小鼠在剖殺前均禁食12 h。小鼠經(jīng)腹腔注射給予 10%CCl4(300 μl·kg-1)，在腹腔注射 CCl4后不同時點(0、2、6、12、24 和 72 h)分別采集血液。處死后迅速取出肝臟組織，稱重，分別取約0.5 cm×0.5 cm大小組織置于4%多聚甲醛溶液中，制備石蠟切片，其余肝臟組織置于-80℃冰箱保存待用。

1.3 血清肝生化指標檢測 用ALT試劑盒測定血清ALT活性。

1.4 HE染色法觀察肝組織病理學(xué)變化 肝臟組織置于4%多聚甲醛固定液中固定12-24 h后，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、脫蠟、梯度乙醇水化、常規(guī)HE染色和光學(xué)樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)改變并拍照。

1.5 TUNEL技術(shù)檢測肝組織凋亡 肝臟組織切片厚度5 μm，常規(guī)脫蠟至水化，用40 mg·L-1蛋白酶K進行細胞通透;后經(jīng)平衡液濕盒平衡10 min;加TUNEL反應(yīng)混合液(rTdT:生物素標記的dUTP:平衡液=1∶1∶98)進行標記反應(yīng)，37℃恒溫烤箱中孵育90 min;再加 SSC溶液終止反應(yīng)，以0.3%H2O2溶液進行封閉，接著加HRP標記的鏈霉親和素孵育30 min，用DAB法顯色，經(jīng)復(fù)染、脫水、透明、封片。用光學(xué)顯微鏡(×100)觀察凋亡發(fā)生情況并計數(shù)。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測肝組織GRP78的分布肝臟組織切片厚度 5 μm，常規(guī)脫蠟至水化，用0.3%H2O2進行細胞通透和封閉內(nèi)源性過氧化物酶;放入0.01 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中，微波修復(fù)抗原;用5%的羊血清來封閉非特異性蛋白，37℃恒溫箱，30 min;GRP78一抗孵育，37℃恒溫烤箱中30 min，再置4℃冰箱過夜;二抗孵育，37℃恒溫烤箱中30 min;再進行SP反應(yīng)，DAB顯色，經(jīng)復(fù)染、脫水、透明、封片。用光學(xué)顯微鏡(×100)觀察GRP78組織分布情況并拍照。

1.7 Western blot技術(shù)檢測ERS信號分子 取肝臟組織制備勻漿，上清定量和變性，變性蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，分別用GRP78、p-IRE1α、p-JNK、CHOP 及 Caspase-12抗體孵育3 h，DPBST浸洗液浸洗4次(每次10 min)，用DPBS洗1次(7 min)，用羊抗鼠IgG二抗孵育2 h，DPBST浸洗液浸洗4次(每次10 min)，用 DPBS洗1次(7 min)，用ECL發(fā)光液孵育5 min后壓X線片，顯影和定影。運用Image-Pro Plus5.0圖像分析軟件測定各蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 CCl4引起急性肝損傷 與對照組(0 h)相比，CCl4處理組小鼠肝重、肝臟系數(shù)和ALT水平均明顯升高(Tab 1，P＜0.01)。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CCl4處理24 h后肝臟ALT升高最為明顯(Tab 1，P＜0.01)。HE染色結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)CCl4處理后不同時點(2、6、12、24和72 h)肝細胞出現(xiàn)不同程度的壞死，壞死程度隨CCl4處理時間延長而逐漸加重，在24 h最為明顯，之后逐漸減弱，呈明顯的時間效應(yīng)關(guān)系(Fig 1)。

2.2 CCl4引起肝細胞凋亡 TUNEL技術(shù)檢測CCl4引起的肝臟細胞凋亡。實驗結(jié)果顯示，經(jīng)CCl4不同時點(2、6、12、24 和 72 h)處理后，僅在 24 h 出現(xiàn)大量的凋亡細胞(Fig 2)。

2.3 CCl4對肝細胞中ERS標志蛋白表達的影響

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，經(jīng)CCl4處理后不同時點(2、6、12、24 和 72 h)，小鼠肝臟出現(xiàn)不同程度的GRP78分布，GRP78的表達隨著作用時間增加而逐漸增強，在24 h分布最廣，24 h之后逐漸減弱(Fig 3)。Westernblot檢測結(jié)果顯示，CCl4處理后，GRP78、p-IRE1α、p-JNK、CHOP等ERS標志蛋白的表達隨著CCl4作用時間的延長而明顯增加，p-IRE1α在2 h即開始升高，GRP78在6 h明顯升高，下游信號因子p-JNK和CHOP于24 h升高最明顯，后逐漸減弱(Fig 4)。

Tab 1Effects of CCl4on the physiologic and serum parameters±s，n=4)

Tab 1Effects of CCl4on the physiologic and serum parameters±s，n=4)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Control 0 h CCl 4 2 h 6 h 12 h 24 h 72 h Body weight/g 30.3±1.3 29.9±0.3 28.4±0.2 30.4±0.2 29.4±2.0 28.5±1.4 Live weight/g 1.35±0.08 1.39±0.06 1.40±0.06 1.65±0.11＊＊ 1.63±0.09＊＊ 1.79±0.13＊＊Liver to body weight ratio/% 0.044±0.00 0.046±0.00 0.049±0.00＊＊ 0.054±0.00＊＊ 0.056±0.00＊＊ 0.063±0.00＊＊ALT/U·L-1 8.25±3.53 19.38±8.12* 64.17±19.91＊＊840.24±527.63＊＊13 066.67±1 074.60＊＊ 40.36±20.12＊＊

Fig 1 Effects of CCl4on pathomorphology ofhepatic histology determined by HE staining(×100)

Fig 2 Effects of CCl4on hepatic apoptosisdetermined by TUNEL(×100)

Fig 3 Effects of CCl4on distribution of GRP78 in hepatichistology determined by immunohistochemical staining(×100)

2.4 CCl4對肝細胞中促凋亡因子蛋白水平的影響

在 CCl4處理后不同時點(2、6、12、24 和 72 h)，肝臟促凋亡因子Caspase-12裂解水平隨CCl4作用時間增加而逐漸增強，至24 h最強，至72 h逐漸減弱(Fig 5)。

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCl4處理組小鼠肝臟重量和肝臟臟器系數(shù)明顯增加，并伴有血清ALT水平明顯升高;HE染色發(fā)現(xiàn)肝臟出現(xiàn)明顯的組織充血、細胞水腫及局灶性壞死。TUNEL檢測結(jié)果顯示，肝臟在CCl4處理后24 h發(fā)生明顯的肝細胞凋亡，與Shi等［8］報道的研究結(jié)果相一致。近年研究證實，肝臟細胞凋亡在肝臟損傷中起重要作用［9-10］;進一步觀察發(fā)現(xiàn)，瘦素通過抗凋亡和抗氧化作用保護CCl4引起的急性肝損傷，提示肝細胞凋亡與急性肝損傷程度具有直接關(guān)系［11］。

越來越多的研究證實，ERS在細胞凋亡過程中起重要作用［12-14］。目前已知 ERS條件下，雙鏈RNA活化蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)通路、活性轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)通路和肌醇需要蛋白1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)通路被激活［12］。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78，GRP78)是發(fā)生 ERS的效應(yīng)標志分子，與3條通路的激活密切相關(guān)［15］。近年來的研究顯示，肝臟ERS發(fā)生時，3條信號通路均可被激活。其中，PERK和IRE1α磷酸化可分別激活其下游分子CHOP和JNK，繼而誘發(fā)肝臟細胞凋亡，在急性肝損傷中起重要作用［13，16］。此外，ERS發(fā)生時可直接激活Caspase-12，不依賴經(jīng)典的死亡受體或線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡通路，引起細胞凋亡［17］。本實驗結(jié)果表明，給予小鼠CCl4處理后，肝細胞ERS效應(yīng)標志分子GRP78蛋白水平明顯上調(diào)，肝臟p-IRE1α、p-JNK及CHOP等ERS標志蛋白明顯升高，裂解型Caspase-12蛋白水平也明顯增加，提示CCl4引起小鼠急性肝損傷過程發(fā)生ERS。本研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞凋亡發(fā)生在CCl4處理后24 h，明顯滯后于ERS和Caspase-12激活的發(fā)生(2h開始即逐漸增強)，表明ERS在肝細胞凋亡中可能發(fā)揮重要作用。

Fig 4 Effects of CCl4on expression levels of GRP78，p-JNK，p-IRE1α and CHOP

Fig 5 Effects of CCl4on expression levels of cleaved Caspase-12

綜上所述，急性CCl4處理明顯升高小鼠肝臟GRP78、p-IRE1α和 p-JNK蛋白水平，上調(diào)肝臟CHOP蛋白表達，提示急性CCl4處理誘發(fā)小鼠肝臟ERS?；诩毙訡Cl4處理導(dǎo)致肝臟細胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-12裂解，表明ERS可能參與肝細胞凋亡發(fā)生過程，并在急性肝損傷中可能發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果為今后進一步研究預(yù)防和治療急性肝損傷提供新的藥物作用靶點。

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