陳德良 ，王少揚(yáng)，黃德東，陳 劍

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122；2.南京軍區(qū)福州總院，福建 福州 350025）

乙型肝炎病毒（HBV）特異性CD8+T細(xì)胞（CTL）介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答在控制HBV感染和病毒清除中至關(guān)重要，而辨證分型是中醫(yī)治療慢性乙型肝炎（CHB）的基礎(chǔ)，慢乙肝不同中醫(yī)證型與特異性CTL應(yīng)答之間可能存在一定相關(guān)性。本研究通過(guò)對(duì)中醫(yī)辨證分型為濕熱中阻型和肝郁脾虛型CHB患者的PBMC在體外經(jīng)特異性抗原和混合肽段誘導(dǎo)下CTL應(yīng)答效應(yīng)的觀察，探討HBcAg、HBsAg、混合肽段對(duì)其CTL細(xì)胞應(yīng)答的影響，為慢性乙型肝炎免疫治療及中醫(yī)辨證分型提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要抗體及試劑 人重組 HBcAg、HBsAg、混合肽段（HBcAg18－27，5′-FLPSDFFPSV-3′；HBcAg60－68，5′-VCWGELMNL-3′；HBsAg183-191，5′-FLLTRILTI-3′）及植物血凝素（PHA）購(gòu)于上海寶曼生物科技有限公司；人IFN-γ ELISPOT試劑盒及相關(guān)產(chǎn)品及人淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll-PaqueTM PLUS）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 一般資料 選擇2012年3月—2013年3月南京軍區(qū)福州總院感染科病房及門(mén)診CHB濕熱中阻型和肝郁脾虛型患者各30例。西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2005年12月10日頒布的 《慢性乙型肝炎防治指南》［1］，中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照1991年天津會(huì)議制定的《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)》［2］。排除既往進(jìn)行過(guò)抗病毒治療及HAV、HEV、HCV等病毒感染和其他原因（藥物、酒精、中毒）造成的急慢性肝損害患者。2組患者在性別、年齡、病程等方面比較經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，無(wú)顯著性差異（P＞0.05），具有可比性，見(jiàn)表1。

表1 2組一般資料比較（）

表1 2組一般資料比較（）

組 別濕熱中阻組肝郁脾虛組男21 20 n 30 30女91 0年齡／歲27.47±6.40 29.40±6.93病程／a 9.63±4.52 10.40±4.40

1.3 生化、乙肝血清標(biāo)志物及HBVDNA定量檢測(cè)肝腎功能采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)，乙肝血清標(biāo)志物采用酶聯(lián)免疫法，HBVDNA檢測(cè)采用熒光定量PCR法檢測(cè)。以上檢測(cè)均在我院檢驗(yàn)科完成。

1.4 人外周單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分離和細(xì)胞因子IFN-γ ELISPOT檢測(cè) 無(wú)菌采靜脈血10 mL，用泛影葡胺密度梯度法分離PBMC，并用RPMI 1640完全培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)至1×106個(gè)／mL，按照ELISPOT試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作。先用含10%胎牛血清的PRMI 1640培養(yǎng)基封閉ELISPOT預(yù)包被板1 h，臨用前倒掉封閉液，加入1×106個(gè)／mL人的PBMC（直接用新鮮的PBMC）100 μL。CHB肝郁脾虛和濕熱中阻組加入 20 μg／mL 的混合肽段、HBcAg、HBsAg 各 100 μL 誘導(dǎo)，陽(yáng)性參照組加入 4 μg／mL 的 PHA 100 μL進(jìn)行誘導(dǎo)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)26～36 h后，在每孔中加入100 μL預(yù)冷的去離子水，并在4℃下放置10 min，倒掉液體，用洗滌液洗滌5～7次，每次放置30～60 s，最后一次在吸水紙上扣干。然后向每孔中加入生物素標(biāo)記的anti-IFN-γ單抗，37℃孵育1 h，倒掉液體，用洗滌液洗滌5次，每次放置30～60 s，最后一次在吸水紙上扣干。加入檢測(cè)二抗，在37℃孵育1 h，倒掉液體，用洗滌液洗滌5次，每次放置30～60 s，最后一次在吸水紙上扣干。最后加入顯色劑顯色15～30 min，待出現(xiàn)斑點(diǎn)后立即用自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)。ELISPOT板晾干后用斑點(diǎn)讀板儀計(jì)數(shù)，并記錄斑點(diǎn)數(shù)，計(jì)算IFN-γ數(shù)量以SFC／105PBMC表示，做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPASS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多個(gè)標(biāo)本均數(shù)比較用方差分析。

2 結(jié) 果

2組PBMC經(jīng)HBcAg、HBsAg、混合肽段誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ數(shù)量比較 見(jiàn)表2。

表2 2組PBMC經(jīng)不同誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ 數(shù)量比較（）SFC／105PBMC

表2 2組PBMC經(jīng)不同誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ 數(shù)量比較（）SFC／105PBMC

注：與肝郁脾虛組比較，1） P＜0.05；與 HBsAg比較，2） P＜0.05；與混合肽段比較，3） P＜0.05。

HBcAg 37.60±2.561）2）3）31.27±2.032）3）組 別濕熱中阻組肝郁脾虛組HBsAg 14.33±1.261）10.37±1.47 n 30 30混合肽段14.17±1.621）10.57±1.94

3 討 論

慢性乙型肝炎是嚴(yán)重影響我國(guó)人民健康的傳染病，是導(dǎo)致肝硬化肝癌的主要原因。據(jù)估計(jì)目前我國(guó)有乙肝病毒攜帶者9千萬(wàn)人以上，有2千萬(wàn)以上慢性活動(dòng)性肝炎患者需要治療。現(xiàn)國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的乙肝抗病毒治療措施主要是干擾素和核苷（酸）類(lèi)藥物，前者有效率僅在40%左右，并存在明顯毒副作用；后者雖然有明顯的抗病毒作用，但存在耐藥和停藥后復(fù)發(fā)的局限性，故探尋更有效的治療措施十分必要。HBV特異性CTL應(yīng)答效應(yīng)已有大量試驗(yàn)證明是HBV感染后慢性化和病情發(fā)展的關(guān)鍵因素。在急性自限性HBV感染者多表現(xiàn)為強(qiáng)的多克隆的HBV特異性CTL應(yīng)答效應(yīng)，相反在慢性乙肝患者多表現(xiàn)弱的寡克隆的HBV特異性CTL應(yīng)答效應(yīng)，甚至部分患者缺失［3］，通過(guò)調(diào)節(jié)HBV特異性CTL應(yīng)答是治療慢性乙型肝炎主要途徑。中醫(yī)中藥在調(diào)理人體免疫功能方面有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，而中醫(yī)辨證分型又是中醫(yī)診斷和治療疾病的基礎(chǔ)，所以探討慢性乙型肝炎的中醫(yī)辨證分型與HBV特異性CTL應(yīng)答效應(yīng)相關(guān)性，有可能找到中西醫(yī)結(jié)合治療慢性乙型肝炎的切入點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)共收集慢性乙型肝炎中醫(yī)辨證分型為濕熱中阻型和肝郁脾虛型各30例，通過(guò)對(duì)不同抗原和混合肽段的觀察，乙肝核心抗原作為最強(qiáng)的抗原可誘導(dǎo)較明顯的HBV特異性CTL應(yīng)答，在不同的抗原誘導(dǎo)下濕熱中阻型和肝郁脾虛型相比，前者表現(xiàn)出較明顯的HBV特異性CTL應(yīng)答效應(yīng)。以上結(jié)果提示：如果通過(guò)合理的有效的中西醫(yī)結(jié)合免疫調(diào)節(jié)治療，濕熱中阻型慢性乙肝患者可能會(huì)取得明顯的療效而肝郁脾虛型患者還需要更強(qiáng)的免疫調(diào)控措施打破已存在的免疫耐受。國(guó)內(nèi)部分學(xué)者通過(guò)不同指標(biāo)檢測(cè)或者不同的辨證分型就慢性乙肝免疫狀態(tài)與辨證分型相關(guān)性也進(jìn)行了探討，如王見(jiàn)義等［4］就慢性乙肝濕熱中阻型、肝腎陽(yáng)虛和肝腎陰虛型中CD8+T細(xì)胞和CD4+／CD8+比值進(jìn)行比較，結(jié)果3型CD8+細(xì)胞計(jì)數(shù)逐漸降低而CD4+／CD8+比值逐漸升高，提示不同中醫(yī)證型間存在免疫學(xué)差異。馮建英等［5］就慢性乙型肝炎的虛證和實(shí)證與CTL應(yīng)答效應(yīng)也做了分析，提示實(shí)證CTL應(yīng)答效應(yīng)高于虛證，但低于健康對(duì)照組。我們按國(guó)內(nèi)公認(rèn)的中醫(yī)辨證分型進(jìn)行分型入組，并選擇相對(duì)常見(jiàn)的2型作為研究對(duì)象，就不同抗原誘導(dǎo)CTL效應(yīng)進(jìn)行觀察，為今后選擇更有效的免疫誘導(dǎo)劑打下理論基礎(chǔ)。當(dāng)然中醫(yī)辨證目前還存在不同分型方法，CTL應(yīng)答效應(yīng)特別是特異性CTL應(yīng)答效應(yīng)的檢測(cè)方法還需要進(jìn)一步改進(jìn)和完善。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南［S］.實(shí)用肝臟病雜志，2006，9（1）：8-18.

［2］中國(guó)中醫(yī)藥學(xué)會(huì)內(nèi)科肝病專(zhuān)業(yè)委員會(huì)第四次學(xué)術(shù)會(huì)議.病毒性肝炎中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)［S］.中醫(yī)雜志，1992，33（5）：39—40.

［3］閆杰，謝雯，馮鑫，等.HBcAg特異性CTL在急性乙型肝炎與慢性乙型肝炎急性發(fā)作患者外周血中的數(shù)量差異［J］.世界華人消化雜志，2011，19（4）：404-406.

［4］王見(jiàn)義，韓向暉，王靈臺(tái)，等.慢性乙型肝炎中醫(yī)證型與免疫功能的相關(guān)性研究［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2007，41（9）：35-36.

［5］馮建英，邵建國(guó)，陳琳，等.慢性乙型肝炎中醫(yī)虛實(shí)辨證與機(jī)體特異性細(xì)胞免疫及病毒復(fù)制的關(guān)系探討［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，15（8）：136-138.