郭燕羽 史麗萍

(河北聯(lián)合大學附屬開灤醫(yī)院 河北唐山 063000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥，其發(fā)病機制尚未明確，早期就會出現(xiàn)腎臟微血管內(nèi)皮細胞的損害，其發(fā)生、發(fā)展與血管內(nèi)皮功能障礙和許多生長因子的異常表達密切相關［1］，而VEGF在DN中特異性的表達具有一定意義。積極尋找DN的有效藥物，并在早期階段就給予針對性的治療，對控制和延緩腎臟病變的進展有重要意義。磷酸西格列汀屬于DPP-Ⅳ抑制劑，是新一類降糖藥。本實驗研究顯示，磷酸西格列汀對早期大鼠(DN)VEGF的表達具有影響性，從而為進一步探討DN的發(fā)病機制和治療理論提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立與分組 50只健康雄性SD大鼠，體質量200～220g，購于北京維通利華實驗動物中心。隨機抽取10只作為正常對照組(NC組)，其余40只經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素(str eptozotocin，STZ，劑量65mg/kg)。制備糖尿病大鼠模型，NC組給予等量的0.1mmol/L的檸檬酸緩沖液。72h后，尾靜脈采血，用血糖儀測隨機血糖連續(xù)3次均≥16.7 mmol/L者為糖尿病大鼠模型成立。造模過程中4只大鼠死亡，成功造模36只，并隨機分為糖尿病模型組(DM組)和磷酸西格列汀治療組(SP組)各18只;SP組給予磷酸西格列汀10mg/(kg.d)灌胃，其余兩組給予等量生理鹽水灌胃。

1.2 實驗方法

1.2.1 生化指標的檢測。分別于實驗的3、6、8周末，NS組中隨機抽取3只及其余兩組中隨機抽取6只，分別留取次日尿液、稱體重、腹主動脈放血后處死。收集血、尿標本，檢測血糖(GLU)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)及24h尿蛋白定量(Upro)，用7180型號全自動生化分析儀檢測。

1.2.2 常規(guī)光鏡檢查。解剖后取固定好的腎組織常規(guī)脫水、包埋，制成4～5μm的切片，經(jīng)HE染色。

1.2.3 酶聯(lián)免疫法測定VEGF。切割腎臟組織標本，經(jīng)離心收集上清液備用，采用酶聯(lián)免疫吸附方法檢測VEGF，將純化的VEGF抗體包被微孔板，制定固相抗體，將VEGF抗原加入包被單抗的微孔中，然后與HRP標記的VEGF抗體結合，加底物顯色，用酶標儀在40nm波長下測定吸光度(OD值)，經(jīng)計算得出實際濃度。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)以(s)表示，各組間差異性比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 各組動物造模后體質量、血糖的變化 實驗的3、6、8周末與NC組比較，DM組和SP組大鼠體質量明顯低于NC組(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學意義;與SP組比較，MD組大鼠體質量又低于SP組(P＜0.05)。同時各周末，DM組和SP組血糖明顯高于NC組(P＜0.01)，其差異有統(tǒng)計學意義;而DM組和SP組血糖變化(P＞0.05)，差異無統(tǒng)計學變化，說明磷酸西格列汀較短時間內(nèi)對糖尿病大鼠血糖的影響不大，見表1。

表1 各組大鼠體重、血糖的比較(s)

表1 各組大鼠體重、血糖的比較(s)

注:與NC組比較，#P ＜0.01，與SP組比較，▼P ＜0.05

組別 時間(周)例數(shù)(只)體質量(g)血糖(mmol/L)DM組SP組NC組

2.2 各組動物血肌酐、尿素氮及24h尿蛋白定量的變化 動物實驗證明，3、6、8周末，DM組和SP組與NC組比較，血清中肌酐、尿素氮及24h尿蛋白定量值明顯升高(P＜0.01);而SP組與DM組血肌酐比較明顯降低(P＜0.05)，SP組與DM組尿素氮、24h尿蛋白定量比較明顯降低(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學意義，動物實驗證明，在糖尿病大鼠造模的初期就會出現(xiàn)糖尿病的腎損害，而磷酸西格列汀對于早期腎損害有一定保護作用，見表2。

表2 各組大鼠血肌酐、尿素氮及24h尿蛋白定量的比較(s)

表2 各組大鼠血肌酐、尿素氮及24h尿蛋白定量的比較(s)

注:與NC組比較，#P ＜0.01;與DM組比較，△P ＜0.05，*P ＜0.01

組別 時間(周)例數(shù)(只)Scr(μmol/L)BUN(mmol/L)Upro(mg/24h)

2.3 光鏡觀察 腎臟HE染色:NC組腎小球結構正常，DM組大鼠隨著病變周數(shù)延長，病變越嚴重，可見腎小球體積增大、系膜區(qū)增寬、腎小球基底膜增厚后，SP組與DM組同期相比病變程度有所減輕，見圖1～3。

圖1 8周末NC組(HE染色，400×)

圖2 8周末DM組(HE染色，400×)

2.4 各組大鼠腎臟組織VEGF表達的情況 3、6、8周末，DM組及SP組與NC組比較，大鼠腎組織中VEGF明顯升高(P＜0.01);而SP組與DM組比較明顯降低(3周末P＜0.05;余P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學意義，見表3。

圖3 8周末SP組(HE染色，400×)

表3 組大鼠腎臟組織VEGF表達的比較

3 討論

糖尿病(DM)已成為威脅人類的重大疾病之一，DN是糖尿病常見微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎病的重要原因，其發(fā)病機制及治療已越來越受重視。DN的病理改變最初為腎臟肥大、腎小球血流量增加，接著腎小球系膜細胞增殖、系膜細胞外基質增加、腎小球基底膜增厚，最后發(fā)展成為腎小球硬化［2］。VEGF是一種有效的血管形成和血管通透性誘導因子，促進內(nèi)皮細胞增殖［3］。是腎血管病變中重要的血管活性因子，其異常的表達可能加重了微血管的滲漏和尿蛋白的漏出，導致腎臟的高濾過、基底膜增厚、系膜組織擴張、腎小球肥大，而大量蛋白的漏出又作為獨立因素損傷腎組織，繼而可通過觀察VEGF的的表達情況，了解DN的發(fā)生發(fā)展過程。

二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidaseⅣ，DPP-Ⅳ)是與糖尿病十分相關的酶，CD26是白細胞分化抗原之一，具有獨特的DPP-Ⅳ酶的活性，在腸道、腎臟均有高度表達［4］。在腸道中胰高血糖素樣肽-1(glucagons-like-peptide-1，GLP-1)及GIP(葡萄糖依賴性促胰島素釋放肽)，而這兩種最重要的腸促胰島素素可以有效地增強胰島素分泌，維持餐后血糖的正常水平［5］，但是腸促胰島素在腸道內(nèi)很快被DPP-Ⅳ酶裂解，使其失去調(diào)節(jié)血糖作用。在腎臟中，長期高血糖狀態(tài)使腎上皮細胞分泌CD26增加［6］，導致腎臟局部血管內(nèi)皮生長因子、胰島素樣生長因子及轉化生長因子等的因子表達增加，刺激腎細末細胞增殖、系膜外基質沉積增加，進而導致腎小球基底膜增厚，引起腎小球病理變化，導致腎損害［7］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)磷酸西格列汀這種DPP-Ⅳ抑制劑，可抑制DPP-Ⅳ對腸促胰島素的降解，從而間接增加胰島素的分泌，最終達到調(diào)節(jié)血糖的目的［8］。本實驗通過磷酸西格列汀藥物干預治療，觀察VEGF在糖尿病腎病大鼠中的表達情況，證明DPP-Ⅳ一類藥物，對早期糖尿病大鼠腎臟有一定保護作用，并能延緩其DN的進展。但是觀察大鼠的血糖并沒有見到顯著變化，然而在實驗過程中，發(fā)現(xiàn)隨著周期的增加，血糖也有下降趨勢，也同樣啟發(fā)血糖的變化是否與實驗周期過短有關，還需不斷深入研究。

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