施文驍，王洪凱，郭慶元

(1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究所，浙江杭州 310058;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

葡萄根癌病是溫帶葡萄種植區(qū)的一個極具破壞性、毀滅性的病害，由細(xì)菌侵染引起，可在葡萄藤上存活并繁殖，并能引起葡萄產(chǎn)量的下降，甚至導(dǎo)致葡萄藤的枯死［1］。早期對歐洲或美國的葡萄根癌病的描述和報道都來自Hedgecock［2］。但在1897年，Cavara［3］首次證明，造成意大利葡萄根癌病的病原是一種傳染性細(xì)菌 (Bacillus ampelopsorae)。1907年，Smith等［4］在美國首次從巴黎的菊花上分離到了根癌病病原菌，研究發(fā)現(xiàn)，將病原菌接種到多種植物上，均能表現(xiàn)出致瘤性。1948年，Braun和Mandle通過試驗(yàn)證明了Agrobacterium tumefaciens的致病因子的存在;1973年，Panagopoulos和Psallidas比較了分離自葡萄和來源于其他植物的根癌農(nóng)桿菌的菌株，證明了侵染葡萄的菌株與其他根癌農(nóng)桿菌的菌株在遺傳上有明顯差別。到1990年，Ophel和Kerr將侵染葡萄的根癌農(nóng)桿菌的菌株定為一個新種 Agrobacterium vitis。雖也有報道 A．rhizogenes可引起葡萄根癌病，且來自分子和脂肪酸的研究表明，A．vitis和A．rhizogenes的親緣關(guān)系很近，但大量試驗(yàn)確認(rèn)，葡萄根癌病的主要的病原菌是 Agrobacterium vitis［5-6］。

1 葡萄根癌病的癥狀及侵染循環(huán)

1.1 癥狀

葡萄根癌病主要癥狀是形成葡萄根部的癌腫。病原菌可在傷口侵入植物體內(nèi)，進(jìn)而導(dǎo)致植物細(xì)胞產(chǎn)生過量的植物生長激素，從而生成根瘤或其他次生增大?？纱嬖谟谝赘腥镜闹参锝M織和根部，也可在枝條等部位也會產(chǎn)生癌腫。當(dāng)其存在于植物根部時，可破壞植物根冠對水和礦物元素的吸收，導(dǎo)致植物生長不良。此外，病害還會侵染葡萄植株的形成層和維管組織，影響營養(yǎng)的運(yùn)輸和葡萄藤的健康。葡萄根癌病會使葡萄逐漸枯梢，嚴(yán)重時可導(dǎo)致藤蔓死亡。發(fā)病時，樹干下部的韌皮部細(xì)胞也會因病而亡，導(dǎo)致類似環(huán)剝的影響［7］。

1.2 侵染循環(huán)

該病的病原菌是一種細(xì)菌，主要通過傷口或孔口進(jìn)入植物體內(nèi)，引起系統(tǒng)性侵染。受病原菌感染的植物部位可一直保持正常，直至該部位受傷。造成傷口的原因很多，如冷凍損傷、移植栽培、修剪維護(hù)等原因是造成葡萄發(fā)病的重要誘因。農(nóng)事措施如藤條嫁接、抹芽等也會造成傷口，從而被病原菌侵染而存在病癥。

葡萄根癌病的初次發(fā)病通常在初夏。根癌病的侵染分為3個步驟。首先是病原體進(jìn)入植物的非原質(zhì)體部位。葡萄土壤桿菌會特別集中在葡萄的根際，且一般通過根和地下傷口部位進(jìn)行侵染［8-9］。第2步為細(xì)菌在木質(zhì)部的定殖。葡萄土壤桿菌系統(tǒng)地定殖在葡萄植株上，并通過木質(zhì)部的液流散布到植株的各個部位［10-11］。第3步包括了對植物反應(yīng)的逃避以及對植物防衛(wèi)機(jī)制的抑制。例如，細(xì)菌的katA基因編碼的過氧化氫酶可降解植物所產(chǎn)生的過氧化氫［12-13］。根據(jù)侵染部位和發(fā)病條件的不同，病害迅速發(fā)展時，癌腫在一個生長季即可環(huán)繞葡萄藤一圈，而發(fā)展緩慢時，這個過程則需要幾年。當(dāng)秋天來臨時，癌腫會變得干燥、暗黑色并壞死。

葡萄根癌病的病原菌平時存在于葡萄周圍的土壤中，可在葡萄的根部越冬。病原菌通過感染地下根冠及受傷部分，入侵到植物體內(nèi)并通過維管束感染植物其他部位的細(xì)胞。隨后，冠癭、根癌會在植物生長的過程中逐步形成。隨著枯死的莖與藤的掉落與轉(zhuǎn)移，病原菌也隨之轉(zhuǎn)移。在土壤中至少生活2年以上。隨著葡萄植株上新的傷口的產(chǎn)生，從而侵染其他的葡萄植株。

2 病原菌的致病機(jī)制

葡萄根癌病菌可在葡萄植株的根部定殖，并通過維管束散布到整株植株，同時可自主逃避植物的防御反應(yīng)。Agrobacterium vitis擁有大量的Ti和Ri質(zhì)粒，這些質(zhì)粒上編碼的蛋白是致病因子的來源。T-DNA可進(jìn)入植物細(xì)胞的核基因，進(jìn)而表達(dá)TDNA編碼植物激素形成的酶［14］。

2.1 T-DNA侵入到植物細(xì)胞

葡萄根癌病菌從傷口侵染的過程中，隨著寄主傷口的愈合，完成T-DNA的轉(zhuǎn)化，之后隨寄主細(xì)胞的分裂出現(xiàn)癥狀。在葡萄生產(chǎn)管理過程中，或自然逆境下，如嫁接導(dǎo)管連接的發(fā)展和嫁接時的組織修復(fù)和重建，凍害以及葡萄園設(shè)備所造成的物理傷害等過程都可造成傷口。這些傷口愈合過程中可形成愈傷組織，而癌腫也隨之產(chǎn)生［14-15］。在果園中，腫瘤的生長通常會出現(xiàn)在接穗愈合的周圍、植株的下部軀干和扦插去頂?shù)牟课唬蜻@些部位都會出現(xiàn)傷口愈合，同時又對T-DNA的侵入高度敏感。

Ti質(zhì)粒上存在著毒力基因，這些基因表達(dá)的蛋白在T-DNA轉(zhuǎn)移中起到重要的作用［15-18］。在這些毒力基因中，VirA和VirG是雙組分的檢測體系，VirA是傳感蛋白，VirG為轉(zhuǎn)錄的生長調(diào)節(jié)劑，VirA在特定的職務(wù)酚類物質(zhì)的作用下引起傷口愈合，VirG能增加所有毒力基因的轉(zhuǎn)錄;VirD4和virB的蛋白為轉(zhuǎn)移T-DNA和其他毒力蛋白所必需;VirD2是T-DNA傳輸過程中的引導(dǎo)蛋白，而VirE2為腫瘤形成所必需［13，19］。

2.2 T-DNA整合到植物核基因上

葡萄根癌病T-DNA轉(zhuǎn)移到植物核基因中誘導(dǎo)癌腫形成的［20］。整合到植物染色體中的細(xì)菌 TDNA含有植物生長素和細(xì)胞分裂素的基因可導(dǎo)致植物細(xì)胞生長素 (吲哚-3-乙酸)和細(xì)胞分裂素的高水平表達(dá)，2個基因的過量表達(dá)會使葡萄藤形成腫瘤［21-22］。

植物生長素需要2個生化途徑來合成。第一步是iaaM基因的表達(dá)，這誘導(dǎo)了色氨酸單加氧酶的產(chǎn)生。隨后色氨酸單加氧酶將色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚乙酰胺。第2步則是iaaH基因表達(dá)吲哚乙酰胺的水解酶。隨后吲哚乙酰胺水解酶將吲哚乙酰胺轉(zhuǎn)變成植物生長素。植物體內(nèi)的T-DNA的表達(dá)以及激素產(chǎn)生水平的提高打斷了常規(guī)的細(xì)胞循環(huán)。這是因?yàn)橹参锛?xì)胞不能對T-DNA的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。這些反常的植物細(xì)胞增殖導(dǎo)致了植物癌腫的生成［13］。

3 葡萄根癌病的防治和檢測

3.1 檢測

對葡萄根癌病進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測是進(jìn)行病害防治的前提，也是早期防治預(yù)警和預(yù)防的基礎(chǔ)。當(dāng)病原菌潛伏在土壤中時，通過各種手段將土壤中的病原菌檢測出來，在發(fā)病前對其進(jìn)行根除。

通常對病原菌的鑒定主要是通過PCR的方法，而病原細(xì)菌主要進(jìn)行擴(kuò)增的基因則是16 S～23 S及其周圍序列。但農(nóng)桿菌的Agrobacterium tumefaciens，Agrobacterium vitis，Agrobacterium rhizogenes 3 個主要的致病種中，其16 S基因的序列很相似。分析IVS在23rRNA基因中的差別發(fā)現(xiàn)，其中存在有長和短2種類型，在A.V中有一些的長型和A.T很相似，同時在A.V中有另一些的長型和A.R很相似;有2個A.V菌株中同時含有這2個類型的IVS，且含有A.T和A.R的IVS。這說明在農(nóng)桿菌的不同種中，基因可進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移并重組。而A.T在這3個種當(dāng)中的可變度最高，說明通常的檢測手段是行不通的。目前研究已發(fā)現(xiàn)很多的新引物可用于進(jìn)行葡萄根癌病的病原菌檢測［23-28］。

3.1.1 PCR方法的早期檢測

設(shè)計一對特異性引物可以對根癌病進(jìn)行快速檢測。根據(jù)TMR位點(diǎn)的特異性和敏感性可獲得1對檢測根癌農(nóng)桿菌的引物。在測試的細(xì)菌中，只有A．tumefaciens可產(chǎn)生236 bp目標(biāo)片段。特異性PCR系統(tǒng)的敏感性由一個巢式PCR擴(kuò)增決定，這可控制模板DNA的拷貝數(shù)［29］。virD2基因也可作為根癌農(nóng)桿菌檢測的特異性基因，并可通過定量PCR的方法對其進(jìn)行檢測［30］。擴(kuò)增生物群1根癌農(nóng)桿菌的T-DNA上的基因5和TMS2之間的243-bp的DNA片段可用來進(jìn)行葡萄根癌病的檢測。這些引物與菌株毒力100%正相關(guān)，而與無毒的100%負(fù)相關(guān)，從而有利于實(shí)時 PCR的檢測［31］。一個葡萄土壤桿菌特異性DNA片段 (pAVS3)可通過引物URP2R來進(jìn)行PCR多態(tài)性條帶的擴(kuò)增。通過從不同的土壤桿菌屬物種的基因組DNA進(jìn)行Southern雜交證實(shí)，該片段在A．vitis中具有特異性。再設(shè)計引物，通過巢氏PCR對其進(jìn)行檢測［32］(表1)。因此，通過病原菌上的特異片斷可對該病進(jìn)行早期的檢測。

表1 用于PCR檢測的特異性引物

3.1.2 電子鼻的檢測

所謂的電子鼻是一個能夠進(jìn)行固相微量取樣的探頭，取樣后可以直接與氣質(zhì)色譜分析連用。從而區(qū)別健康和感病的葡萄植株。感病的葡萄植株中可以將肉桂酸脫羧成苯乙烯，而正常植株中不含這種氣體。通過頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜法分析目標(biāo)葡萄植株樣品的揮發(fā)性物質(zhì)的特性。主成分分析證實(shí)了被感染的葡萄藤和健康的葡萄藤的揮發(fā)物質(zhì)的區(qū)別［33］。

3.2 防治方法

3.2.1 普通方法

由于細(xì)菌生長在木質(zhì)部中，所以目前為止沒有有效的化學(xué)防治方法［7］。防治葡萄根癌病主要在于預(yù)防，預(yù)防葡萄植株受傷和同時維護(hù)健康的藤蔓，除去死亡和生病的組織可減輕病害的發(fā)生。

3.2.2 基因工程

現(xiàn)在基因工程的方法在很多領(lǐng)域都得到應(yīng)用，也包括對葡萄根癌病的防治。

基因工程能輔助葡萄育種，產(chǎn)生抗病和抗逆的葡萄。目前全球?qū)ζ咸研枨蟮脑黾哟偈沽诉@門科學(xué)的快速發(fā)展。將外源基因轉(zhuǎn)化葡萄并進(jìn)行表達(dá)，從而使葡萄獲得抗逆性和抗病性。例如抑制病原菌的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)抗菌肽。盡管轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性并不是很強(qiáng)，但相比非轉(zhuǎn)基因的防治，MAG-2或MSI99基因表達(dá)使得癌腫的發(fā)病率下降［24］。

將葡萄根瘤農(nóng)桿菌的致病基因突變后轉(zhuǎn)入葡萄植株中，可提高對根癌農(nóng)桿菌的抗性［25］。根據(jù)幾個以前的嵌入T-DNA的VirE2輸出整合阻礙理論研究顯示，抗性提高是因?yàn)橥蛔兊腣irE2蛋白和功能的VirE2蛋白的競爭的聯(lián)系。在植物細(xì)胞內(nèi)，競爭的出現(xiàn)阻礙了T-DNA進(jìn)入整合到植物細(xì)胞核中［15-18］。

3.2.3 生物防治

生物控制是防治葡萄根癌病最有效的方法之一，采用非致病細(xì)菌菌株接種到葡萄植株及其生長的土壤中，從而達(dá)到減輕或防止根癌農(nóng)桿菌為害［26］。

目前已有20多個生防菌株用于防治葡萄根癌病。放線菌株產(chǎn)生的K84就是生物防治的一個代表，但k84并不能完全成功的控制住葡萄根癌病。Rahnella aquatilis(水生拉恩氏菌)的菌株HX2可對葡萄根癌病進(jìn)行生物防治，抑菌的主因是產(chǎn)生了一種抗菌物質(zhì)，它與其他菌株相比能產(chǎn)生較大的抑菌圈及較低的最低抑菌濃度，能抑制Agrobacterium vitis中RNA和蛋白質(zhì)的合成。有多種非致病的農(nóng)桿菌亦可對葡萄根癌病進(jìn)行生物防治［13，27］。

4 小結(jié)

隨著生活水平的提高，人們對農(nóng)產(chǎn)品安全和環(huán)境要求更高，葡萄根癌病的防治引起人們的重視。葡萄根癌病作為土傳病害，傳統(tǒng)的防治方法防控效果不盡人意。生物防治對環(huán)境的影響小，對葡萄產(chǎn)品安全，但無論使用天然菌株的生物控制，或轉(zhuǎn)基因拮抗菌株的生物控制，或利用轉(zhuǎn)基因的葡萄來防止葡萄根癌病，這些方法至今還在進(jìn)一步研究中。因此，通過基因工程和生物防治方法來選育抗性品種是預(yù)防葡萄根癌病發(fā)生的有效方法之一。同時開展快速檢測方法的研究，可對該病害早期快速準(zhǔn)確檢測和提早預(yù)警，在剛發(fā)病甚至未發(fā)病時做到發(fā)現(xiàn)并消除病原，從而達(dá)到有效防控的效果。

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