趙鐵華，文 曙，鄧淑華，楊鶴松，曹 凱

(1.河北師范大學(xué)藥物研究所，河北石家莊 050024;2.懷化市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南懷化 418000;3.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北 承德 067000)

聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修飾是延長腦啡肽(enkephalin，ENK)及其類似物體內(nèi)半衰期、改善其中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)釋放的可行策略之一［1－2］。本文對2 ku和5 ku分子質(zhì)量直鏈甲氧基聚乙二醇(mPEG2000和mPEG5000)修飾的甲硫氨酸腦啡肽(Met-enkephalin，MEK)進(jìn)行了以未修飾原型肽為對照的鎮(zhèn)痛藥效評價，并采用125I標(biāo)記方法對MEK及其mPEG2000修飾物進(jìn)行了體內(nèi)分布分析。

1 材料與方法

1.1 受試化合物MEK-Cys-NH2、MEK-Cys(mPEG2000-MAL)-NH2、MEK-Cys(mPEG5000-MAL)–NH2為本實(shí)驗(yàn)室采用Fmoc固相方法合成，RPHPLC方法純化，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于0.95;MS鑒定，MEK-Cys-NH2分子質(zhì)量為 677u，MEK-Cys(mPEG2000-MAL)–NH2在2 708 u附近有一組相差44的峰，MEK-Cys(mPEG5000-MAL)–NH2在5 708 u附近有一組相差44的峰，與預(yù)期相符;使用時以生理鹽水溶解，0.45 μm濾膜過濾除菌。嗎啡為東北第六制藥廠生產(chǎn)，批號001009;生理鹽水稀釋至使用濃度。125I標(biāo)記 MEK-Cys-NH2和 MEK-Cys(mPEG2000-MAL)-NH2委托中國原子能研究院同位素研究所采用氯胺T法制備，經(jīng)PR-HPLC分離純化。標(biāo)記物放射性比活性分別為MEK-Cys-NH21.480 Bq· g-1、MEK-Cys(mPEG2000-MAL)-NH22.405 Bq·g-1，放化純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))高于0.95;生理鹽水稀釋至使用濃度。

1.2 主要儀器 智能熱板儀:RB-200型，成都泰盟科技有限公司生產(chǎn);γ計數(shù)器:MF-1000型，西安凱普公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物及其分組 KM小鼠，清潔級，體質(zhì)量18 g～22 g［中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所繁育場提供，合格證號 SCXK(京)2004-0001］。按實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇動物性別，分層隨機(jī)方法分組。其中鎮(zhèn)痛試驗(yàn)分為陰性(NS)對照、陽性藥物(Mor)對照以及各受試化合物組，并設(shè)修飾物mPEG2000-MAL和mPEG5000-MAL對照，每組10只以上小鼠。125I標(biāo)記肽體內(nèi)分布試驗(yàn)按 10、30、60、120、240 min 測定時相分別分為125I標(biāo)記的MEK和mPEG修飾MEK組，每組6只小鼠。部分小鼠因采血量不足或基礎(chǔ)痛閾值不符合要求等原因廢棄，數(shù)據(jù)未進(jìn)入統(tǒng)計處理過程。

1.4 熱板致痛模型側(cè)腦室注射給藥鎮(zhèn)痛試驗(yàn) ♀KM小鼠，實(shí)驗(yàn)前1 d在局部消毒條件下剪去小鼠頭頂部注射部位(Bregma點(diǎn)后1 mm，中線旁開2 mm)直徑0.5～0.8 cm皮膚，并預(yù)防性肌肉注射青霉素1次。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日在20℃ ±1℃室溫條件下，置小鼠于55℃ ±0.5℃熱板，以接觸熱板至舔后足所經(jīng)歷的時間為痛閾值;剔除痛閾值小于3 s和大于30 s小鼠;合格小鼠分層隨機(jī)分組;各小鼠給藥前間隔5 min測量痛閾值2次，取平均值作為藥前(基礎(chǔ))痛閾值。各受試物組小鼠分別側(cè)腦室注射3.1 μmol·kg-1(嗎啡等摩爾濃度)受試物，陽性藥物對照組小鼠側(cè)腦室注射嗎啡1.0 mg·kg－1，注射容積每只4 μl，陰性對照組小鼠注射等容積生理鹽水。分別觀察記錄給藥后15、30、60、120 min各小鼠的痛閾值，并計算各小鼠給藥前后痛閾值的差值。

1.5 醋酸致痛模型靜脈注射給藥鎮(zhèn)痛試驗(yàn) KM小鼠，♀♂兼用，分組方法同上。各受試物組小鼠分別按31 μmol·kg－1(嗎啡等摩爾濃度)尾靜脈注射受試物，陽性藥物對照組小鼠尾靜脈注射嗎啡10 mg·kg－1，注射容積為0.2 ml·(10 g)－1，陰性對照組小鼠按體重注射等容積生理鹽水。給藥后30 min，各小鼠腹腔注射0.1 mol·L-1冰乙酸(AA)0.2 ml致痛，以小鼠出現(xiàn)腹部肌肉反復(fù)收縮、拱背、臀部扭轉(zhuǎn)、后肢伸展為扭體陽性反應(yīng)。記數(shù)15 min內(nèi)扭體次數(shù)，并計算疼痛抑制率。

疼痛抑制率/%=(陰性對照組扭體次數(shù)－實(shí)驗(yàn)組扭體次數(shù))/陰性對照組扭體次數(shù)×100%

1.6 體內(nèi)分布試驗(yàn)［3］KM小鼠，♀♂兼用，隨機(jī)分組。尾靜脈注射5.55～7.40 GBq·L-1濃度125I標(biāo)記的MEK-Cys-NH2或MEK-Cys(mPEG2000-MAL)-NH2，容積 0.2 ml·(10 g)－1。分別于注射后 10、30、60、120、240 min 眶后靜脈取血后脫頸椎處死小鼠，取肝、腦、腎等器官(組織)，稱重并以γ計數(shù)器測定cpm值，計算不同時相的放射性攝取量(每克組織攝取的放射性占總注射量的百分比，%ID/g)。

2 結(jié)果

2.1 mPEG修飾MEK的鎮(zhèn)痛藥效評價

2.1.1 mPEG修飾MEK側(cè)腦室給藥對小鼠熱刺激所致疼痛反應(yīng)的影響 Tab 1可見，陽性對照藥嗎啡表現(xiàn)了預(yù)期的鎮(zhèn)痛活性，并且試驗(yàn)及對照各組間藥前(基礎(chǔ))痛閾值差異無顯著性，具有可比性。與陰性對照(NS)組比較，經(jīng)mPEG修飾的MEK鎮(zhèn)痛活性明顯，其中mPEG5000修飾物的明顯鎮(zhèn)痛活性持續(xù)至120 min(P＜0.01)，并且在120 min時間點(diǎn)鎮(zhèn)痛活性高于嗎啡(P＜0.05)。經(jīng)F檢驗(yàn)，在30、60、120 min時間點(diǎn)MEK及mPEG修飾物3組間差異有顯著性(P＜0.05或0.01);3組間兩兩比較，mPEG5000修飾物各時間點(diǎn)的鎮(zhèn)痛活性均強(qiáng)于未修飾MEK，60和120 min時作用強(qiáng)于mPEG2000修飾物(P＜0.05或0.01)，60 min時mPEG2000修飾物作用強(qiáng)于未修飾MEK(P＜0.05)。等劑量mPEG2000-MAL和mPEG5000-MAL側(cè)腦室注射未產(chǎn)生明顯鎮(zhèn)痛作用。

Tab 1 Effects of MEK modified by PEG of the painful mice induced by on hot-plate injected through icv on hot-plate pain test in mice

2.1.2 mPEG修飾MEK靜脈給藥對小鼠醋酸刺激所致疼痛反應(yīng)的影響 見Tab 2

Tab 2 Effects of MEK modified by PEG of the painful mice induced by acetic acid injected through iv on body twisting induced by AA in mice

Tab 2結(jié)果，陽性對照藥嗎啡表現(xiàn)了預(yù)期的鎮(zhèn)痛活性。與NS組比較，MEK和mPEG修飾各組鎮(zhèn)痛活性明顯(P＜0.01)。經(jīng)F檢驗(yàn)，MEK及mPEG修飾3組間差異有顯著性(P＜0.05);3組間兩兩比較，mPEG5000修飾物作用分別強(qiáng)于mPEG2000修飾和未修飾MEK(P＜0.05和0.01)。等劑量mPEG2000-MAL和mPEG5000-MAL靜脈注射未產(chǎn)生明顯鎮(zhèn)痛作用。

2.2 MEK及其mPEG2000修飾物的體內(nèi)分布分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Tab 3，血液中125I標(biāo)記的未修飾MEK清除較快，240 min時與mPEG2000修飾物放射性攝取量比較差異有顯著性(P＜0.01);mPEG2000修飾物的血液半衰期()較未修飾MEK增加3倍(分別為174.11 min和57.96 min)，清除率(CL)下降2.2倍;2種125I標(biāo)記肽的腎臟分布較高，腦組織中的分布和清除時間未表現(xiàn)明顯差異;10 min時相，125I標(biāo)記mPEG2000修飾物的肝臟放射性攝取量明顯低于未修飾MEK(P＜0.01)。

3 討論

腦啡肽的快速酶解破壞、較高的肝臟清除以及通過血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的困難是影響其成藥性的重要障礙［4-6］;Arizona大學(xué)進(jìn)行的糖基化腦啡肽和聚乙二醇修飾腦啡肽類似物的研究提示，化學(xué)修飾是克服以上困難，改善腦啡肽及其類似物成藥性的可行策略［1－2］。根據(jù)蛋白質(zhì)和多肽類聚乙二醇修飾的既往研究資料［7-10］，腦啡肽及類似物經(jīng)PEG化修飾后可以降低體內(nèi)酶降解、延長半衰期;并且根據(jù)聚乙二醇獨(dú)特的雙親理化性質(zhì)，經(jīng)適當(dāng)分子量PEG修飾的腦啡肽可能提高通過BBB的能力。

Tab 3 Biodistribution of MEK-Cys-NH2and MEK-Cys(mPEG2000-MAL)-NH2marked with125I in normal mice

本實(shí)驗(yàn)對分子質(zhì)量為2 ku和5 ku的mPEG修飾MEK鎮(zhèn)痛藥效及體內(nèi)分布情況進(jìn)行了比較。在MEK序列中加入Cys的目的是利用某些mPEG衍生物特異性修飾游離Cys的特征［11］，為短肽提供C-末段的PEG定點(diǎn)修飾部位。與Arizona大學(xué)以腦啡肽類似物DPDPE氨基基團(tuán)作為修飾位點(diǎn)的PEG修飾方案［1－2］比較，本方案設(shè)計的 mPEG修飾部位可能有利于避免被修飾的MEK(Tyr-Gly-Gly-Phe-Met)序列活性必需的Tyr和第3位Gly、第4位Phe殘基被屏蔽，保留肽活性［12］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在本實(shí)驗(yàn)涉及分子量范圍內(nèi)，mPEG修飾可增強(qiáng)側(cè)腦室和靜脈2種途徑注射MEK的鎮(zhèn)痛作用，較大分子量(5 ku)mPEG修飾對MEK鎮(zhèn)痛活性增強(qiáng)表現(xiàn)更加明顯，并且鎮(zhèn)痛時間明顯延長。分析mPEG修飾增強(qiáng)和延長MEK鎮(zhèn)痛表現(xiàn)的原因，可能與其腦部攝取增加及外周藥代動力學(xué)改變相關(guān)。

體內(nèi)分布分析，125I標(biāo)記的mPEG2000修飾MEK在10 min時肝臟分布明顯低于未修飾MEK(P＜0.01)，并且在240 min時血液分布高于未修飾MEK(P＜0.01)，血液半衰期)是原型MEK的3倍，體內(nèi)清除率(CL)較原型MEK下降2.2倍，結(jié)果與藥效表現(xiàn)吻合。其可能的解釋是mPEG修飾導(dǎo)致MEK肝膽清除下降，體內(nèi)的存在時間增加，與相應(yīng)受體結(jié)合的時間增加。125I標(biāo)記MEK及其mPEG2000修飾物的腎臟放射性攝取量最大，提示二者的主要清除部位為腎臟。

盡管Arizona大學(xué)等的研究工作已經(jīng)肯定了PEG修飾可改善腦啡肽及其類似物的CNS釋放能力［1－2］，但本實(shí)驗(yàn) m PEG5000修飾 M EK 靜 脈注射時鎮(zhèn)痛表現(xiàn)明顯增強(qiáng)結(jié)果提示的“適當(dāng)分子量PEG修飾可能改善MEK通過BBB的能力”的實(shí)驗(yàn)推論，尚缺乏直接的體內(nèi)分布數(shù)據(jù)支持。本實(shí)驗(yàn)靜脈注射125I標(biāo)記的mPEG2000修飾MEK的腦組織分布與未修飾MEK無明顯差異，與mPEG2000修飾MEK靜脈注射時的鎮(zhèn)痛活性與未修飾MEK一致的表現(xiàn)吻合，是否說明所采用mPEG在分子量較小情況下尚不足以明顯改善被修飾MEK通過BBB的能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。

在目前已知提高肽類藥物CNS釋放的脂化、糖基化、陽離子化、提高酶解穩(wěn)定性、載體連接以及聚合物連接等結(jié)構(gòu)改造方法中，PEG修飾是最受專注的技術(shù)之一;研究認(rèn)為其主要原理基于PEG的雙親理化性質(zhì)，并且被修飾物體內(nèi)循環(huán)時間的增加延長了暴露于BBB血管內(nèi)皮細(xì)胞的時間，與BBB的可飽性或與P物質(zhì)親和力的逆轉(zhuǎn)有關(guān)［1－2］。

本文報道的適當(dāng)分子量PEG修飾MEK鎮(zhèn)痛活性的增強(qiáng)、體內(nèi)半衰期和鎮(zhèn)痛表現(xiàn)時間的延長、以及肝膽清除減少的趨勢，與Arizona大學(xué)聚乙二醇修飾腦啡肽及其類似物的研究結(jié)論［1－2］一致，對改善腦啡肽及其類似物的成藥性具有積極意義。

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