邊佳明，吳 寧，李 錦

(1.北京軍區(qū)總醫(yī)院藥理科 北 京 100700;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，毒物藥物研究所 北京 100850)

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤是起源于胚胎期神經(jīng)嵴細(xì)胞的一種兒童常見(jiàn)惡性腫瘤，SH-SY5Y細(xì)胞株即來(lái)源于該腫瘤細(xì)胞，是一種分化程度較低的腫瘤細(xì)胞［1］。該細(xì)胞繁殖較慢，細(xì)胞形態(tài)、生理和生化功能與正常神經(jīng)細(xì)胞相似，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制和藥物作用機(jī)制方面的研究。該細(xì)胞表面表達(dá)有內(nèi)源性的阿片受體，其數(shù)量接近神經(jīng)組織［2］，因此該細(xì)胞系被廣泛用于體外細(xì)胞水平阿片依賴研究的模型。維甲酸(retinoic acid，RA)可誘導(dǎo)該細(xì)胞向神經(jīng)元形態(tài)分化，且以全反式維甲酸(all-trans RA)誘導(dǎo)分化能力最強(qiáng)［3］。嗎啡急性激動(dòng)阿片受體后抑制腺苷酸環(huán)化酶(AC)，而這一效應(yīng)可在RA誘導(dǎo)該細(xì)胞向神經(jīng)元形態(tài)分化后得到增強(qiáng)［4］，可能與分化后細(xì)胞的阿片受體表達(dá)量的改變有關(guān)。本研究采用放射性配體受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)確定阿片受體表達(dá)量，為合理使用SH－SY5Y細(xì)胞系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 RA(all-trans)，納洛酮，苯甲基磺酰氟(PMSF)等購(gòu)自 Sigma-Aldrich(美國(guó))，3H-diprenorphine(50Ci/10－6mol·L－1)購(gòu)自 NEN(美國(guó))，GF/C玻璃纖維濾紙購(gòu)自Whatman(美國(guó))，其余所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心，維持于含10% 胎牛血清(FBS)，1 ×105IU·L－1青霉素，100 mg·L－1鏈霉素的 DMEM/F12培養(yǎng)基(GibcoTM，美國(guó))中，37℃，5%CO2培養(yǎng)。取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞置25 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，80%匯片后1∶3傳代，隨即分為對(duì)照組和誘導(dǎo)分化組，對(duì)照組給予含等量DMSO的培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化組給予含1×10－5mol·L－1終濃度RA的培養(yǎng)基培養(yǎng)。連續(xù)分化6 d，每2天換液一次。第7天鏡下觀察細(xì)胞分化情況，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 放射性配體受體結(jié)合實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞膜蛋白提取參照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定膜蛋白濃度。反應(yīng)體系 5×10－4L，［3H］Diprenorphine終濃度梯度為 2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 × 10－9mol·L－1，納洛酮終濃度為 1 ×10－5mol·L－1，反應(yīng)體系用5 ×10－5mol·L－1Tris緩沖液(pH=7.4)配_制，每管膜蛋白4×10－5g。37°C孵育30 min后立即冰水浴終止反應(yīng)，迅速抽濾3次，取下濾紙烤干，加入閃爍液，隔夜用β液閃儀記錄放射強(qiáng)度。特異結(jié)合量=總結(jié)合量－非特異結(jié)合量。

2 結(jié)果

2.1 RA誘導(dǎo)后SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化RA誘導(dǎo)分化6天后，SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)變化明顯。與對(duì)照組細(xì)胞(Fig 1A)相比，誘導(dǎo)分化組細(xì)胞(Fig 1B)更加圓潤(rùn)，細(xì)胞突起明顯增多，增長(zhǎng)，形成軸突樣神經(jīng)纖維，且構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，表明低分化的SHSY5Y細(xì)胞正在向成熟神經(jīng)元方向分化。誘導(dǎo)分化6 d后的細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)分化組細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組(Fig 2)，約為同步對(duì)照細(xì)胞數(shù)量的25%左右。

Fig 1A Appearance of control cells under microscope(×20)Fig 1B Appearance of RA-induced cells under microscope(×20)

Fig 2 SH-SY5Y cells count at 6th day after differentiation induction by RA

2.2 RA誘導(dǎo)后SH-SY5Y細(xì)胞阿片受體表達(dá)上調(diào)受體結(jié)合飽和試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照細(xì)胞比較，RA誘導(dǎo)分化后SH-SY5Y細(xì)胞阿片受體表達(dá)明顯上調(diào)。飽和曲線擬合后，兩組細(xì)胞膜阿片受體表達(dá)量(Bmax)存在極明顯差異，RA連續(xù)誘導(dǎo)分化6天后阿片受體表達(dá)量增加了約1.68倍;兩組細(xì)胞Kd值比較無(wú)顯著差異，表明受體親和力未受RA誘導(dǎo)分化的影響(Tab 1)。

Tab 1 Saturated binding fitting parameters of［3H］-diprenorphine

3 討論

阿片受體分布廣泛，在鎮(zhèn)痛和依賴研究中具有十分重要的地位，其中對(duì)μ阿片受體的研究最為廣泛和深入?；蚯贸龑?shí)驗(yàn)證實(shí)，μ阿片受體的表達(dá)對(duì)于鎮(zhèn)痛、軀體依賴和精神依賴等生理病理過(guò)程是必須的［6］。阿片受體偶聯(lián)Gi/o蛋白，受體激活導(dǎo)致部分亞型AC活性受抑制，cAMP合成減少，PKA活性下降;而阿片受體的長(zhǎng)期激活則導(dǎo)致AC超敏，突然中止對(duì)受體的激動(dòng)，如納洛酮催促的戒斷，則導(dǎo)致cAMP反跳性增高，又稱之為cAMP超射，這一現(xiàn)象被普遍認(rèn)為是阿片依賴的機(jī)制之一［7］。

SH-SY5Y細(xì)胞是阿片依賴研究中常使用的一種細(xì)胞系，原生表達(dá)μ阿片受體，且受體表達(dá)量與真實(shí)腦組織的表達(dá)量類似［2］。RA可以誘導(dǎo) SHSY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化，但分化后μ阿片受體的表達(dá)如何變化還少有研究，這對(duì)于在阿片依賴研究中合理使用SH-SY5Y細(xì)胞非常重要。利用RA我們成功誘導(dǎo)了SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化，表現(xiàn)為細(xì)胞突起增多增長(zhǎng)，形成軸突樣神經(jīng)纖維，并且細(xì)胞間的神經(jīng)纖維交錯(cuò)成為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。RA誘導(dǎo)分化組細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯較對(duì)照組細(xì)胞減慢，提示RA抑制了細(xì)胞的增殖，這一點(diǎn)也被國(guó)內(nèi)王希華等［8］的研究所證實(shí)，而RA本身并無(wú)促凋亡作用。佟海俠等［9］也發(fā)現(xiàn)，維甲酸誘導(dǎo)SH-SY5Y可以明顯導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)神經(jīng)元樣改變，且神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)向成熟神經(jīng)元方向分化，細(xì)胞生長(zhǎng)速率減慢。Ammer等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，RA誘導(dǎo)分化6 d可導(dǎo)致Giα亞基明顯上調(diào)，這與阿片受體表達(dá)上調(diào)似乎是一致的。

Diprenorphine是阿片受體拮抗劑，對(duì)三種亞型(μ，δ，κ)的阿片受體都有很高的親和力，尤其是對(duì)κ和μ亞型。有研究表明［2］，SH-SY5Y細(xì)胞上表達(dá)有μ和 δ受體，比例大約為5∶1。也有研究［11］認(rèn)為SH-SY5Y細(xì)胞上表達(dá)有較多的κ受體。因?yàn)槲覀兊难芯坷茫?H］-diprenorphine作為放射性配體測(cè)定受體表達(dá)量，并不能明確是何種亞型阿片受體在誘導(dǎo)分化后發(fā)生變化。我們發(fā)現(xiàn)對(duì)照細(xì)胞的阿片受體膜表達(dá)量約為77×10－12mol·g－1膜蛋白，這與Lawrenc［12］的報(bào)道基本一致。Jenab 等［13］報(bào)道 RA誘導(dǎo)分化后，SH-SY5Y細(xì)胞μ受體mRNA表達(dá)增加了2倍;Zadina等［14］報(bào)道RA誘導(dǎo)分化后，SH-SY5Y細(xì)胞μ受體數(shù)量上調(diào)40%;我們的研究顯示，誘導(dǎo)分化后細(xì)胞膜阿片受體表達(dá)提高了約1.6倍，與上述文獻(xiàn)基本一致。阿片受體的表達(dá)量與下游信號(hào)強(qiáng)度相關(guān)，我們的研究為合理使用SH-SY5Y細(xì)胞作為阿片依賴細(xì)胞模型提供了數(shù)據(jù)支持。

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