越茂松，黃 瓊，王進(jìn)京，季秋虹，季煜華，3

(1.暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 組織移植與免疫研究中心廣州 510632，2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南通 226001，3.暨南大學(xué)功能蛋白質(zhì)研究廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣州 510632)

缺血性腦卒中是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致成年死亡和殘疾的重要原因，但目前除了溶栓治療外還缺乏其他理想的治療藥物和手段［1］。乙?；且环N重要的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(Histone acetyltransferases，HATs)和組蛋白去乙?；?Histone deacetylases，HDACs)維持和調(diào)節(jié)著機(jī)體中蛋白質(zhì)乙?；降膭?dòng)態(tài)平衡［2］。近年來，一系列的報(bào)道證實(shí)了卒中以及多種神經(jīng)退行性疾病(HD，

Alzheimer等)都伴隨著HATs蛋白量/活性的下降和HDACs活性的相對(duì)增加，而通過組蛋白去乙?；敢种苿?Histone deacetylase inhibtor，HDACis)抑制HDACs的活性，增加乙?；娇山档蜕窠?jīng)元損傷的程度并促進(jìn)其功能的恢復(fù)［3－5］。曲古抑菌素A(TSA)是一種泛去乙?；敢种苿ㄟ^改變?nèi)旧|(zhì)折疊構(gòu)象調(diào)節(jié)基因表達(dá)和改變蛋白質(zhì)乙?；秸{(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能。［4，6］本研究擬檢測 TSA對(duì) PC12細(xì)胞OGD損傷模型的作用并探討可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 PC12，ATCC;TSA，碧云天生物技術(shù)研究所;DMEM無糖培養(yǎng)基，美國Sigma公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和馬血清，美國Gibco公司;MTT，美國 Sigma公司;DCFH-DA，碧云天生物技術(shù)研究所;超凈工作臺(tái)(水平流型)，中國ESCO公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(2300型)，美國公司Sheldon公司;倒置顯微鏡(COICXSZ-D2型)，日本尼康公司;680型酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司;熒光顯微鏡，日本尼康公司;流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇后接種于用多聚賴氨酸包被過的培養(yǎng)瓶中，用含5%胎牛血清(FBS)和10%馬血清(HS)的高糖DMEM完全培養(yǎng)基在5%CO2，37℃條件下恒溫、恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞匯合度70% ～80%時(shí)按1∶4傳代。

1.2.2 MTT檢測TSA對(duì)細(xì)胞增殖的影響 按1×104個(gè)細(xì)胞/孔、200 μl接種用多聚賴氨酸包被過的96孔板，在5%CO2、37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，換成含不同濃度TSA的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，處理 48 h 后，每孔加入5 g·L－1MTT 20 μl，再培養(yǎng)4 h，每孔加入三聯(lián)裂解液150 μl過夜，待孔內(nèi)顆粒完全溶解后，用酶標(biāo)儀，選擇波長570 nm，檢測各孔吸光度(A)，抑制率%=1－A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果做統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 參考文獻(xiàn)方法稍加改進(jìn)建立缺糖/缺氧模型，取處于對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞按1×104個(gè)/孔、200 μl接種于用多聚賴氨酸包被過的96孔板中，在5%CO2、37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，將其分為 blank control、model control和OGD組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。OGD組設(shè)六個(gè)濃度，分別加入含 CoCl2為 25、50、100、200、400、800 μmol·L－1的無糖 DMEM 培養(yǎng)基 100 μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)2 h，用MTT法檢測細(xì)胞存活率，確定最佳造模濃度。

1.2.4 利用PI和Hochest染色檢測細(xì)胞凋亡與壞死 取處于對(duì)數(shù)期的PC12細(xì)胞按1×105個(gè) /孔、600 μl接種于用多聚賴氨酸包被過的24孔板，分組，細(xì)胞貼壁過夜，將各組舊培養(yǎng)基小心吸出后，用PBS洗兩遍，將其分為blank control、model control和OGD組。OGD組設(shè)3個(gè)濃度，分別加入含CoCl2為50、200、800 μmol·L－1的無糖 DMEM 培養(yǎng)基300 μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)2 h，小心吸干上清后，用PBS洗兩遍，加入0.01 g·L－1Hoechst 33258和0.01 g·L－1PI(用PBS溶液配制成0.01 g·L－1)各100 μl，避光反應(yīng)10 min吸棄上清，用PBS洗兩遍后，加入含10%FBS的PBS 200 μl，熒光顯微鏡觀察攝像。PI熒光為紅色(620 nm)，Hoechst 33258熒光為藍(lán)色(480 nm)。

1.2.5 MTT法檢測細(xì)胞存活率 按1×104個(gè)細(xì)胞/孔、200 μl接種用多聚賴氨酸包被過的96孔板，分組，將其分為control組，OGD組，給藥組。給藥組設(shè)7 個(gè)濃度，分別為:1、10、40、80、160、320、640 nmol·L－1。每組設(shè) 6個(gè)復(fù)孔，在 5%CO2、37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，將各組舊培養(yǎng)基吸出后control組加入100 μl完全培養(yǎng)基，給藥組含不同濃度TSA的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，將除control外的其他各組的舊培養(yǎng)基小心吸出后，用PBS洗兩次，OGD 組加入含 CoCl2100 μmol·L－1的無糖 DMEM培養(yǎng)基100 μl，給藥組加入含不同濃度TSA的OGD培養(yǎng)液100 μl，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，每孔加入終濃度為 5 g·L－1的 MTT 溶液 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入三聯(lián)裂解液150 μl過夜，待孔內(nèi)顆粒完全溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測儀，選擇波長570 nm，檢測各孔吸光度(A)。

1.2.6 檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧含量

1.2.6 .1 熒光顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧含量 取對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞消化收集并接種于24孔板中，貼壁過夜。分別加藥處理，并設(shè)陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。給藥組造模前提前4 h加入不同濃度TSA處理，2 h后小心吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入200 μl按照1 ∶1000用 PBS稀釋好的DCFH-DA，使終濃度為 10 μmol·L－1。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用PBS洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。最后每孔加入500 μl PBS，陽性對(duì)照組加入1 μl活性氧陽性對(duì)照刺激物Rosup。20 min后用熒光顯微鏡在波長485 nm激發(fā)光下觀察。

1.2.6 .2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧含量 取對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞消化收集并接種于6孔板中，貼壁過夜。分別加藥處理，并設(shè)陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。給藥組造模前提前4 h加入不同濃度TSA處理，2 h后收集細(xì)胞到相應(yīng)流式管中，每管加入 400 μl終濃度為 10 μmol·L－1的 DCFH-DA，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min用PBS洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。最后每孔加入500 μl PBS，陽性對(duì)照組加入1 μl活性氧陽性對(duì)照刺激物Rosup。20 min后用流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 TSA對(duì)PC12細(xì)胞增殖活性的影響 隨著TSA濃度升高，細(xì)胞的增殖活性逐漸降低，從5 nmol·L－1起明顯抑制增殖活性(P＜0.05)，并在160 nmol·L－1時(shí)抑制50%的增殖活性，見Fig 1。

2.2 PC12細(xì)胞缺糖/缺氧損傷模型的建立 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著CoCl2濃度的增加細(xì)胞存活率相應(yīng)下降。實(shí)驗(yàn)選擇PC12細(xì)胞OGD損傷2 h，存活率為61%時(shí) CoCl2濃度為 100 μmol·L－1作為下一步實(shí)驗(yàn)造模濃度。見Fig 2。

Fig 1 Survival rate of PC12 cell with TSA for 48 h( ± s)

Fig 2 Survival rate of PC12 cell with CoCl2for 2 h(n=6)

2.3 利用PI和Hochest染色檢測細(xì)胞凋亡與壞死實(shí)驗(yàn)觀察隨著CoCl2濃度的增加，與blank control相比，細(xì)胞凋亡與壞死的數(shù)量不斷增加，尤其是800 μmol·L－1CoCl2組最為明顯。結(jié)果見Fig 3。

Fig 3 Cell apoptosis and necrosis observed in PI and Hoechst staining(10×10)

2.4 TSA對(duì)缺糖/缺氧損傷的PC12細(xì)胞存活率的影響 MTT法檢測顯示，10～160 nmol·L－1TSA組全程作用6 h后，經(jīng)缺糖/缺氧損傷的PC12細(xì)胞存活率與模型組相比差異有顯著性(P＜0.05)，特別是80 nmol·L－1的TSA組與OGD組相比其存活率提高了29%。結(jié)果見Fig 4。

Fig 4 Effect of TSA on survival rate of OGD on PC12 cells( ± s)

2.5 熒光顯微鏡檢測PC12細(xì)胞活性氧的含量采用DCFH-DA熒光探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PC12細(xì)胞經(jīng)OGD損傷2 h后，ROS生成量明顯增加;TSA全程處理的PC12細(xì)胞OGD損傷2 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS生成量與OGD處理組比較明顯減少，特別是80 nmol·L－1TSA+OGD組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TSA能夠拮抗OGD損傷造成的PC12細(xì)胞內(nèi)ROS的增加。結(jié)果見Fig 5。

Fig 5 Effect of TSA on oxygen content of active cells(10×10)

2.6 流式細(xì)胞儀檢測PC12細(xì)胞內(nèi)活性氧含量采用DCFH-DA熒光探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量進(jìn)行測定。流式細(xì)胞儀顯示的數(shù)據(jù)與熒光顯微鏡的結(jié)果吻合。PC12細(xì)胞經(jīng)OGD損傷2 h后，ROS生成量明顯增加，TSA全程處理的PC12細(xì)胞OGD損傷2 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS生成量與OGD組相比較明顯減少，特別是80 nmol·L－1TSA+OGD組。由此證明80 nmol·L－1TSA+OGD能明顯拮抗OGD損傷造成的PC12細(xì)胞內(nèi)ROS的增加。結(jié)果見Fig 6。

Fig 6Effect of TSA on oxygen content of active cells(±s)

3 討論

目前認(rèn)為神經(jīng)元損傷是缺血性腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制中的重要因素，損傷涉及多方面，其包括能量代謝障礙、ROS損傷、神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)失衡(鈣、鈉離子超載)、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、線粒體損傷及細(xì)胞凋亡等。［7－9］在這些諸多的損傷因素中，能量代謝障礙可能是首發(fā)環(huán)節(jié)，因此緩解細(xì)胞能量代謝障礙被認(rèn)為是治療缺血性卒中的一個(gè)重要的治療靶點(diǎn)［10］。

實(shí)驗(yàn)運(yùn)用CoCl2合并無糖培養(yǎng)基模擬細(xì)胞缺血損傷過程，建立了體外神經(jīng)元的缺血模型。［11］發(fā)現(xiàn)100 μmol·L－1CoCl2合并缺糖 2 h，細(xì)胞存活率為61%，且細(xì)胞無明顯的壞死，因此適宜用此濃度建模。通過大量MTT前期實(shí)驗(yàn)篩選出PC12細(xì)胞添加TSA的最佳方案，即通過TSA對(duì)PC12細(xì)胞預(yù)處理4 h，OGD過程也同時(shí)加入TSA(全程加入法)、TSA只對(duì)PC12細(xì)胞預(yù)處理4 h(預(yù)處理法)和OGD過程同時(shí)加入TSA(同時(shí)加入法)三種處理方案的MTT數(shù)據(jù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)全程加入法對(duì)細(xì)胞的保護(hù)效果最佳。

近期文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞中參與糖酵解，糖異生，三羧酸循環(huán)，尿素循環(huán)，脂肪酸循環(huán)，糖原代謝中的多種酶都會(huì)被乙?；揎?，并且細(xì)胞外能量物質(zhì)的濃度將直接影響這些代謝過程中酶的乙?；潭龋?2，13］。然而近期有文章指出，許多參與糖酵解和脂肪代謝的酶的乙?；潭戎苯佑绊懫浠钚?，乙?；潭雀?，則酶活性強(qiáng)。已經(jīng)證實(shí):GADPH的乙酰化加速糖酵解的反應(yīng)，增加烯酰-COA水合酶和3-L-羥脂酰-COA的乙酰化水平也促進(jìn)脂肪代謝，最終產(chǎn)生AC-COA，進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)產(chǎn)生的NADH，F(xiàn)ADH2再進(jìn)行氧化磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生大量 ATP［10］。MTT結(jié)果顯示，與 OGD組相比，80 nmol·L－1TSA預(yù)處理PC12細(xì)胞4 h可明顯提高細(xì)胞的存活率。由于TSA處理時(shí)間較短(4 h)，因此有可能是通過增加能量代謝過程中一些關(guān)鍵酶的乙?；揎?，從而增加或維持細(xì)胞內(nèi)能量的釋放，以應(yīng)對(duì)因OGD引起的能量代謝障礙，進(jìn)而提高細(xì)胞的存活率，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用。

腦缺血造成的能量代謝障礙將促使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，它們與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、及核酸發(fā)生反應(yīng)引起膜脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致膜損傷，線粒體功能障礙，細(xì)胞溶解和組織水腫等一系列損害作用［8］。研究結(jié)果顯示80 nmol·L－1TSA預(yù)保護(hù)組的胞內(nèi)ROS生成量明顯下降。因此，TSA對(duì)OGD損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，可能通過增加能量代謝酶的乙?；?，緩解缺血引起的能量障礙，進(jìn)而降低細(xì)胞OGD損傷引起的ROS生成量，但具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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