王建榮，陳麗芝，羅長(zhǎng)財(cái)，鐘開新，聶金梅，李陽(yáng)源

（廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東珠海519060）

脂肪酶（Lipase，E.C.3.1.1.3），全稱為三酰基甘油酰水解酶（triacylglycerol acylhydrolase），它屬于α/β折疊酶家族，是一種絲氨酸水解酶。脂肪酶催化三酰甘油的酯鍵水解，釋放更少酯鍵的甘油酯或甘油及脂肪酸[1]。脂肪酶主要來源于動(dòng)植物和微生物中，相對(duì)于動(dòng)植物，微生物分泌的脂肪酶具有更廣的底物專一性、作用溫度以及作用pH范圍。脂肪酶在微生物界分布很廣，目前已發(fā)現(xiàn)曲霉[2]、根霉[3]、假單胞菌[4]等多種微生物可產(chǎn)脂肪酶。在眾多來源的脂肪酶中，來源于假單胞菌屬的脂肪酶廣泛應(yīng)用于各個(gè)工業(yè)領(lǐng)域，包括食品工業(yè)、洗滌工業(yè)、手性拆分和藥物合成等領(lǐng)域中。如門多薩假單胞菌的脂肪酶用于洗滌劑添加劑、熒光假單胞菌和銅綠假單胞菌的脂肪酶則被廣泛用于有機(jī)合成等[5]。由于來源于假單胞菌的脂肪酶具有良好的應(yīng)用特性，為了進(jìn)一步提高假單胞菌分泌脂肪酶的能力，許多學(xué)者開始應(yīng)用分子生物學(xué)的方法研究其脂肪酶基因的克隆、表達(dá)、調(diào)控等。到目前為止已有多種假單胞菌的脂肪酶基因被克隆并且實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，如熒光假單胞菌[6]、銅綠假單胞菌[7]、洋蔥勃克霍爾德菌[8]等。本研究采用同源克隆法得到了門多薩假單胞菌的脂肪酶基因并對(duì)該基因進(jìn)行了分析，同時(shí)將該基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33中，進(jìn)行了初步的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，為進(jìn)一步研究該基因奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

表達(dá)載體pPICZαA、Pichia pastoris X-33 購(gòu)自Invitrogen公司；門多薩假單胞菌Pseudomonas mendocina P10 購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌Top10、高保真Pfu酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRI、NotI、質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒、PCR純化試劑盒 均購(gòu)自上海生工公司；PCR引物合成以及DNA測(cè)序 均由深圳華大基因公司完成；其他生化試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Biometra熱密閉PCR儀T-1 德國(guó)Biometra公司；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；Nano Drop分光光度計(jì)ND-1000 美國(guó)Nano Drop公司；電泳儀DYY-6C 北京市六一儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 門多薩假單胞菌基因組DNA的提取 挑取單菌落接入50mL LB液體培養(yǎng)基中，30℃，150r/min培養(yǎng)過夜，離心取菌體，參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。用Nano Drop分光光度計(jì)（ND-1000）測(cè)定DNA的濃度，選取A260/A280值在1.8～2.0的樣品，置于冰箱中-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 脂肪酶基因的克隆 經(jīng)過分析NCBI上已報(bào)道的Pseudomonas mendocina NK-01的全基因組DNA序列（Genebank登錄號(hào)為：CP002620.1），設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，上游引物：5’-ATCGGAATTCATGGCCAGTCTTCC GCTGTAT-3’和下游引物：5’-ATATGCGGCCGCCTA GCCCTTCATCGGCGCATC-3’（分別含有EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)）。以提取的門多薩假單胞菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：DNA模板1μL（約50ng），上、下游引物各2μL，2×Pfu Master Mix 50μL，用ddH2O補(bǔ)充到總體積為100μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min后，分別于94℃變性50s，58℃退火50s和72℃延伸1min，共33個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定正確后切膠純化存于冰箱中-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 表達(dá)載體pPICZαA-pml的構(gòu)建 pPICZαA質(zhì)粒和目的基因PCR產(chǎn)物都用EcoRI和NotI進(jìn)行雙酶切，切膠純化后，用T4DNA連接酶16℃過夜連接酶切產(chǎn)物，然后用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E.coli Top10，在含25μg/mL Zeocin的LB培養(yǎng)基平板上涂板，過夜培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定。將陽(yáng)性質(zhì)粒提交華大基因公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.4 序列分析 核酸和氨基酸序列的比對(duì)在NCBI BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）上進(jìn)行，核酸序列分析用DNAman 5.0完成，蛋白結(jié)構(gòu)與功能的預(yù)測(cè)在Swissprot（http：//www..expasy.ch/sprot）網(wǎng)站上提供的鏈接的平臺(tái)上進(jìn)行。

1.2.5 重組畢赤酵母的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)以及酶活檢測(cè) 重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SacI進(jìn)行線性化后，使用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到畢赤酵母X-33，取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有100μg/mL的Zeocin YPD平板上，30℃培養(yǎng)2～3d，進(jìn)行菌落PCR鑒定。挑取經(jīng)菌落PCR鑒定的轉(zhuǎn)化子，接種于含有50mL BMGY培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃，250r/min振蕩培養(yǎng)16～20h至OD600達(dá)到2～6。離心收集菌體，再將其重懸浮于BMMY培養(yǎng)基中，稀釋至OD600為0.8～1.0，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔24h向BMMY培養(yǎng)基中補(bǔ)加甲醇至終濃度為1.0%進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)測(cè)定重組菌的菌體濃度和脂肪酶酶活。脂肪酶活性定量測(cè)定采用堿滴定法，具體步驟參照文獻(xiàn)[9]中報(bào)道的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 門多薩假單胞菌脂肪酶基因pml的克隆及序列比對(duì)

以提取的門多薩假單胞菌基因組DNA為模板，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見PCR產(chǎn)物大小約為820bp，大小與理論值相符（見圖1）。將該目的片段回收并克隆入表達(dá)載體pPICZαA，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和NotI雙酶切鑒定，片段大小正確（見圖2），測(cè)序結(jié)果表明，pml基因全長(zhǎng)為801bp，起始和終止密碼子分別為ATG和TAG，推測(cè)其完整的ORF編碼267個(gè)氨基酸。利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST軟件分析表明，推測(cè)的門多薩假單胞菌脂肪酶的氨基酸序列同其他已知細(xì)菌的脂肪酶氨基酸序列有較高的相似性。其中最高的為Pseudomonas mendocina NK01（相似性為97%），其次為Pseudomonas mendocina DLHK（相似性為82%）。采用DNAman 5.0進(jìn)行同源比對(duì)分析（見圖3），發(fā)現(xiàn)門多薩假單胞菌脂肪酶基因pml的氨基酸序列中含有高度保守的“Gly-X-Ser-X-Gly”五肽功能元件。研究表明，該功能元件在脂肪酶識(shí)別和結(jié)合底物方面發(fā)揮著重要的作用[10]。同時(shí)在該脂肪酶氨基酸序列中還發(fā)現(xiàn)了構(gòu)成脂肪酶活性中心催化活性位點(diǎn)的三個(gè)氨基酸殘基（Ser-Asp-His），它們分別位于156、212、247位。通過以上分析表明從門多薩假單胞菌中克隆得到了完整的脂肪酶基因。

圖1 PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Digestion and identification of recombinant plasmid

圖3 脂肪酶氨基酸序列多重比對(duì)圖Fig.3 The multiplex alignment of the lipase

2.2 門多薩假單胞菌脂肪酶基因pml生物信息學(xué)分析

門多薩假單胞菌脂肪酶基因pml編碼297個(gè)氨基酸，利用在線軟件Protparam預(yù)測(cè)表明，該脂肪酶的等電點(diǎn)和相對(duì)分子量大小分別為4.82、29.95ku，半衰期理論值為30h，不穩(wěn)定參數(shù)為61.80，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。利用在線網(wǎng)站SinglelP4.0預(yù)測(cè)信號(hào)肽定位，結(jié)果顯示該氨基酸序列不含有信號(hào)肽。采用在線軟件ProtScale分析此蛋白的疏水性和親水性，發(fā)現(xiàn)第21位的丙氨酸和22位的谷氨酸的疏水性最強(qiáng)（分值為2.189），位于第41位的精氨酸親水性最強(qiáng)（分值為-2.967）。用SOPMA對(duì)此蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，在該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲的含量最大為47.74%，其次為α螺旋含量為34.59%，延伸鏈的含量為15.41%，而β轉(zhuǎn)角的含量最少為2.26%。通過NCBI網(wǎng)站上的conserve domain對(duì)該氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示該序列屬于脂肪酶超家族中的第三類脂肪酶。

2.3 重組畢赤酵母的構(gòu)建以及篩選

Zeocin抗性平板上長(zhǎng)出數(shù)百個(gè)轉(zhuǎn)化子（見圖4），隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR，陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照分別以畢赤酵母X-33的基因組DNA和構(gòu)建好的脂肪酶表達(dá)載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖5所示。重組菌和陽(yáng)性對(duì)照都能擴(kuò)增出一條820bp大小的條帶，與預(yù)期大小相符，表明重組質(zhì)粒已成功整合到了畢赤酵母基因組中。

圖4 擬轉(zhuǎn)化子Fig.4 Putative transformants

圖5 擬轉(zhuǎn)化子PCR鑒定Fig.5 PCR detection of putative transformants

2.4 重組轉(zhuǎn)化子脂肪酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活測(cè)定

按照方法“1.2.5”對(duì)篩選的重組畢赤酵母進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔24h取樣測(cè)量發(fā)酵液的菌體濃度和上清發(fā)酵液的脂肪酶酶活。結(jié)果如圖6所示，誘導(dǎo)到168h時(shí)，菌體濃度達(dá)到最高，菌體濃度為432g/L；誘導(dǎo)至192h時(shí)，酶活力達(dá)到最大為8U/mL。

圖6 重組畢赤酵母生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線Fig.6 Cell growth and lipase production of recombinant yeast

3 結(jié)論

采用同源克隆法從門多薩假單胞菌中克隆得到脂肪酶基因，該基因全長(zhǎng)801bp，編碼267個(gè)氨基酸。通過對(duì)該脂肪酶基因的序列及其編碼的氨基酸進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：該脂肪酶基因與已報(bào)道的脂肪酶基因具有很高的相似性，相似性最高可達(dá)97%；同時(shí)在該脂肪酶氨基酸序列中還存在“Gly-X-Ser-X-Gly”五肽功能元件以及脂肪酶活性中心催化活性位點(diǎn)的三個(gè)氨基酸殘基（Ser-Asp-His），通過保守區(qū)域分析，該脂肪酶適于脂肪酶超家族中的第三類脂肪酶。將該脂肪酶基因連接到pPICZαA表達(dá)載體上轉(zhuǎn)化Pichia pastoris X-33，脂肪酶基因在Pichia pastoris X-33中實(shí)現(xiàn)了分泌性表達(dá)。當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間誘導(dǎo)到168h時(shí)，菌體濃度達(dá)到最高，菌體濃度為432g/L；誘導(dǎo)至192h時(shí)，酶活力達(dá)到最大為8U/mL。

[1]Jaeger K E，Eggert T.Lipases for biotechnology[J].Curr Opin Biotechnol，2002，13（4）：390-397.

[2]Shi B，Zeng L，Song H，et al.Cloning and Expression of Aspergillus tamarii FS132 Lipase Gene in Pichia pastoris[J].Int J Mol Sci，2010，11（6）：2373-2382.

[3]顏興和，王棟，徐巖.根霉脂肪酶的研究進(jìn)展[J].工業(yè)微生物，2005，35（3）：45-49.

[4]張博，楊江科，閆云君.假單胞菌脂肪酶的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2007，2：52-57.

[5]Gupta R，Gupta N，Rathi P.Bacterial lipases：an overview of production，purification and biochemical properties[J].Appl Microbiol Biotechnol，2004，64（6）：763-781.

[6]Chung GH，Lee YP，Jeohn GH，et al.Cloning and nucleotide sequence ofthermostable lipase gene from Pseudomonas fluorescens SIK W1[J].Agric Biol Chem，1991，55（9）：2359-2365.

[7]Ogino H，Hiroshima S，Hirose S，et al.Cloning，expression and characterization of a lipase gene（lip3） from Pseudomonas aeruginosa LST-03[J].Mol Genet Genomics，2004，271（2）：189-196.

[8]Jorgensen S，Skov KW，Diderichsen B.Cloning，sequence，and expression of a lipase gene from Pseudomonas cepacia：lipase production in heterologous hosts requires two Pseudomonas genes[J].J Bacteriol，1991，173（2）：559-567.

[9]Saxena R K，Davidson W S，Sheoran A，et al.Purification and characterization of an Alkaline thermostable lipase from Aspergillus carneus[J].Process Biochem，2003，39（2）：239-247.

[10]Tan Y，Miller K J.Cloning，expression，and nucleotide sequence of a lipase gene from Pseudomonas fluorescens B52[J].Appl Environ Microbiol，1992，58（4）：1402-1407.