牛梅麗，徐 慧，李文婧，劉建軍，，*

（1.山東輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，山東濟南250353；2.山東省食品發(fā)酵工程重點實驗室，山東濟南250013）

我國是白酒生產(chǎn)大國，酒糟是白酒生產(chǎn)的副產(chǎn)物，據(jù)統(tǒng)計其年產(chǎn)量超過了3×107t[1]。如果酒糟得不到及時處理會引起腐敗變質(zhì)，浪費資源的同時還會污染環(huán)境。因此解決酒糟的綜合利用問題是非常重要的。目前，酒糟沒有得到有效的利用，主要是用來作為肥料或飼料[1-3]。將酒糟稻殼中同時接入能夠高效降解纖維素的菌株及飼料酵母進行發(fā)酵是當前飼料業(yè)的一個發(fā)展方向，較高的纖維素酶活性及高蛋白含量的飼料酵母可將酒糟稻殼轉(zhuǎn)化為豬禽可利用的成分。既緩解了我國蛋白飼料緊缺情況，又使酒糟得以綜合利用，變廢為寶，保護環(huán)境[3-4]。目前，能夠降解纖維素的菌株有很多，主要為綠色木霉、康寧木霉及黑曲霉等幾個菌株。本文報道了以酸處理后的酒糟廢料為原料篩選出了一株能夠高效降解酒糟稻殼纖維素的菌株，為后續(xù)生產(chǎn)飼料蛋白奠定了基礎(chǔ)，有助于進一步實現(xiàn)酒糟的綜合利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酒糟 來自于山東某釀酒公司；土樣 來自山東、河北、內(nèi)蒙古地區(qū)；富集培養(yǎng)基[5]CMC-Na 1%、K2HPO4·3H2O 0.1%、Na2CO30.5%、MgSO4·7H2O 0.01%、FeSO4·7H2O 0.015%、蛋白胨1%、酵母膏1%，pH自然；篩選培養(yǎng)基 CMC-Na 1%、K2HPO4·3H2O 0.2%、（NH4）2SO40.4% 、MgSO4·7H2O 0.01% 、FeSO4·7H2O 0.015%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.3%、瓊脂2%，pH自然；斜面培養(yǎng)基 土豆200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL，pH自然；液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基 CMC-Na 1%、KH2PO40.4%、（NH4）2SO40.2%、MgSO4·7H2O 0.03%、GaCl2·2H2O 0.03%、蛋白胨0.3%、酵母膏0.2%，pH自然；發(fā)酵培養(yǎng)基 酒糟2%、麩皮1%、KH2PO40.4%、（NH4）2SO40.2% 、MgSO4·7H2O 0.03% 、GaCl2·2H2O 0.03%、蛋白胨0.3%、酵母膏0.2%，pH自然。

SPX-150生化培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司；SPH-111C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海世平實驗設(shè)備有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；722可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；TDL-5-A離心機 上海安亭科學儀器廠；LCT-10S-A凈化工作臺 濟南綠潔空氣設(shè)備廠；SMART生物顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司；UB-7酸度計 美國丹佛。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的篩選方法

1.2.1.1 初篩 酒糟及土樣中的微生物經(jīng)富集培養(yǎng)后，梯度稀釋至適當濃度涂布到篩選培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3～4d，挑取單菌落轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)3～4d，然后劃線到篩選培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)，待長出單菌落后加入1%的剛果紅溶液染色2h，再經(jīng)1%NaCl脫色1h，觀察有無透明圈的產(chǎn)生，并記錄透明圈直徑及菌落直徑的大小。選取透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株進行復(fù)篩[5-6]。

1.2.1.2 復(fù)篩 將初篩分離得到的菌株接種到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃、180r/min培養(yǎng)3d后，測定各菌株發(fā)酵液的纖維素酶酶活，選取酶活較高的菌株[6]。

將測定出的纖維素酶酶活較高的菌株以一株接三瓶的方式接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180r/min培養(yǎng)3d后，測定各菌株纖維素酶的酶活，選取酶活較高且穩(wěn)定的菌株作為目的菌株[7]。

1.2.1.3 纖維素酶活力的測定[7-9]還原糖的測定采用DNS（3，5-二硝基水楊酸）法測定[8]：在540nm處有最大光吸收，在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色成比例關(guān)系，利用比色法測定還原糖的生成量即可測定出纖維素酶的活力。

a.粗酶液的制備 將菌株接種到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃、180r/min培養(yǎng)3d后，將發(fā)酵液于4000r/min離心10min，上清液即為粗酶液[9]。

b.酶活定義 在pH5.0、50℃的條件下，粗酶液每分鐘催化纖維素水解生成1μmol葡萄糖的酶量為一個酶活單位。

c.CMC-Na（羧甲基纖維素鈉）酶活性的測定 取4支干凈的25mL的比色管，分別編號后加入1.5mL pH5.0、1%CMC-Na的檸檬酸鈉緩沖液，將4支管同時放入50℃水浴鍋中預(yù)熱5min后，向1號管中加入0.5mL稀釋后并滅活的粗酶液，其余3支管中加入0.5mL稀釋了相同倍數(shù)的粗酶液。50℃水浴30min后，取出立即加入3mL DNS終止反應(yīng)，混勻后沸水浴5min后，取出立即冷卻，加水定容到10mL。在540nm處以1號管為對照，測定各比色管中溶液的吸光值并記錄。在DNS葡萄糖標準曲線上查出相對應(yīng)的葡糖糖量并計算CMC-Na酶活。

d.濾紙酶活性（FPA）的測定 取4支干凈的25mL的比色管，分別編號后加入1.5mL pH5.0的檸檬酸鈉緩沖液，再分別加入一條1cm×6cm去淀粉的濾紙條，將4支管同時放入50℃水浴鍋中預(yù)熱5min后，向1號管中加入0.5mL稀釋后并滅活的粗酶液，其余3支管中加入0.5mL稀釋了相同倍數(shù)的粗酶液。50℃水浴60min后，取出立即加入3mL DNS終止反應(yīng)，混勻后沸水浴5min，取出立即冷卻，加水定容到10mL。在540nm處以1號管為對照，測定各比色管中溶液的吸光值并記錄。在DNS葡萄糖標準曲線上查出相對應(yīng)的葡萄糖量并計算濾紙酶活。

1.2.2 菌種鑒定 通過形態(tài)特征、《真菌分類鑒定手冊》[10]及18s rDNA全序列分析等手段來鑒定菌種。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩結(jié)果

剛果紅與纖維素大分子結(jié)合顯示出紅色，而不能與小分子的還原糖結(jié)合呈現(xiàn)紅色，產(chǎn)纖維素酶的菌株在CMC-Na平板上生長產(chǎn)生的纖維素酶能夠降解大分子的纖維素為小分子的還原糖，當加入剛果紅染色時，沒有被降解的大分子纖維素與剛果紅結(jié)合顯示出紅色，而被降解為小分子的還原糖不能與剛果紅結(jié)合，從而呈現(xiàn)出透明圈，如圖1所示。其中，透明圈的直徑與菌落直徑的比的大小可以初步判定菌株產(chǎn)纖維素酶酶活力的大小。

表1 不同菌株在CMC-Na平板上的透明圈大小Table 1 The size of transparent circle of different strains on CMC-Na plate

圖1 CMC-Na平板上的透明圈Fig.1 The transparent circle on CMC-Na plate

從土樣及稻殼中初步篩選出了193株菌，經(jīng)剛果紅染色后透明圈大的菌株有60株。表1是在CMC-Na平板上的透明圈直徑與菌落直徑比大于1.5的菌株。

2.2 復(fù)篩結(jié)果

將上述產(chǎn)透明圈較大的60株菌接種到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中復(fù)篩，經(jīng)多次重復(fù)實驗得到酶活力較高的菌株共10株，如表2所示。

表2 10株菌產(chǎn)纖維素酶酶活力的大小Table 2 The cellulose enzyme activity of 10 strains

由表2可知，菌株M2、M5、N53的CMC-Na活性及濾紙酶活性都較高，故將菌株M2、M5、N53以一株接三瓶的方式接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。經(jīng)多次重復(fù)實驗，得復(fù)篩結(jié)果，如表3所示。

表3 纖維素酶產(chǎn)生菌的復(fù)篩結(jié)果Table 3 The results of secondary screening of cellulose producing strains

由表3可知，菌株N53產(chǎn)纖維素酶的酶活最高，穩(wěn)定性較好，故選擇菌株N53作為目的菌株。對比表2與表3結(jié)果，可以看出菌株N53在以發(fā)酵培養(yǎng)基（酒糟稻殼與麩皮）為原料培養(yǎng)時，CMC-Na酶活與濾紙酶活（7.502、0.126U/mL）分別是以CMC-Na（0.731、0.040U/mL）為原料培養(yǎng)時的10倍和3倍，故該菌株更適宜在以酒糟稻殼為主的天然碳源下生長。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 菌株N53形態(tài)觀察 菌株N53在平板上的特征如下：菌落圓形鋪展，向四周成輻射狀，中間成絨狀，孢子成暗綠色，有白色的邊緣，最后變?yōu)楹稚Ｈ鐖D2所示。

圖2 菌落形態(tài)（PDA 30℃ 4d）Fig.2 Colonial morphology（PDA 30℃ 4d）

光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：分生孢子梗有隔膜且較長，比較光滑，頂端排列成帚狀的分枝，分枝1～2次，頂層以切離法生成分生孢子，分生孢子串呈不分枝的鏈狀，單個孢子成橢圓形，光滑無色，如圖3所示。

圖3 分生孢子梗（1000×）Fig.3 Conidiophore peduncle（1000×）

從菌落形態(tài)及顯微鏡觀察，按照《真菌鑒定手冊》檢索表進行檢索，發(fā)現(xiàn)菌株N53與擴展青霉（Penicillium expansum）的特征最為相似。

2.3.2 18S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 18s rDNA是編碼真核生物核糖體小亞基rDNA的DNA序列，序列中既有保守區(qū)又有可變區(qū)，保守序列區(qū)域反映了生物物種間的親緣關(guān)系，而高變序列區(qū)域則能體現(xiàn)物種之間的差異，且18s rDNA在進化速率上比較保守，因此在系統(tǒng)發(fā)育研究中較適用于種級以上階元的分類。通過基因克隆所得的菌株N53的18s rDNA序列全長為1688bp，將序列結(jié)果在NCBI中進行同源序列搜索，根據(jù)搜索結(jié)果，選取同源性較高的菌種的相關(guān)序列進行比對分析。利用MEGA 5.05軟件中的Neighbor-Joining法進行分子生物學分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。結(jié)果表明，菌株N53與Penicillium expansum HDJZ-ZWM-17（GU227344）的遺傳距離最近，核苷酸序列同源性高達99%，因此可以認為菌株N53屬于Penicillium expansum（擴展青霉）。

圖4 菌株N53的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain N53

3 結(jié)論

從酒糟及土樣中分離出了193株能夠降解酒糟稻殼纖維素的菌株，通過多輪篩選確定了一株降解效果較好的菌株N53，通過形態(tài)特征觀察及18s rDNA序列分析等手段，初步鑒定菌株N53為擴展青霉菌（Penicillium expansum）。菌株N53以酒糟稻殼為碳源時產(chǎn)纖維素酶的酶活較高，性能穩(wěn)定，是一株具有應(yīng)用潛力的酒糟稻殼纖維素降解菌株。

[1]李日強，張峰，韓文輝，等.不同菌株固態(tài)發(fā)酵廢白酒糟生產(chǎn)飼料蛋白的研究[J]．重慶環(huán)境科學，2003，25（11）：63-65.

[2]羅輝芬，張慶華，徐國華，等.白酒糟纖維素降解菌種的篩選[J]．微生物學雜志，1997，17（4）：19-22.

[3]徐堅平，劉鈞松，孔維，等.利用秸稈類物質(zhì)進行微生物共發(fā)酵生產(chǎn)單細胞蛋白[J]．微生物學通報，1995，22（4）：222-225.

[4]M K BHAT，S BHAT.Cellulose degrading enzymes and their potential industry applications[J]．Biotechnology Advances，1997，15：583-620.

[5]曲小爽.高效桔青霉纖維素分解菌篩選及酶學初探[D]．哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2009.

[6]Huang Jin-yong，Wang Mei-rong，Wang Bing.Screening and identification ofceIlulose-degradation strain M1 and its characteristics of cellulase[J]．Life Science，2009，3（9）：21-26.

[7]殷中偉.秸稈纖維素高效降解菌株的篩選及對秸稈降解效果初步研究[D]．北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2010.

[8]Manmeet Kaur，Dr S Arora.Isolation and Screening of Cellulose Degrading Bacteria in Kitchen Waste and Detecting Their Degrading Potential[J]．Mechanical and Civil Engineering，2012，2（1）：33-35.

[9]伍時華，徐雅飛，黃翠姬.降解纖維素菌株的篩選[J]．食品科技，2006，8（3）：50-52.

[10]魏景超.真菌分類鑒定手冊[M]．上海：山海出版社，1974.