肖 蒙，孟昭旭，楊曉春，杜 鵬，霍貴成

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030）

乳房炎主要是指一種由致病菌通過乳房導(dǎo)管進(jìn)入乳房內(nèi)不斷繁殖而導(dǎo)致的炎癥[1-2]。當(dāng)奶牛分泌的牛奶中體細(xì)胞數(shù)超過200，000個(gè)/mL時(shí)，就可以診斷此?；加腥榉垦譡3]。據(jù)世界奶牛協(xié)會統(tǒng)計(jì)，全世界約有2.2億頭奶牛，乳房炎的發(fā)病率在50%左右，其中牛臨床型乳房炎患病率為2%，隱性乳房炎高達(dá)50%[4-5]，每年由乳房炎造成的直接經(jīng)濟(jì)損失約為350億美元[6]。奶牛發(fā)生乳房炎不僅可造成產(chǎn)奶量下降10%～15%[7]、乳汁pH升高、奶中營養(yǎng)成分顯著降低，而且還嚴(yán)重影響奶及奶制品的食品安全，因?yàn)槟膛；既榉垦缀笏a(chǎn)的乳汁中含有大量的炎癥因子、致病菌和毒素[8]。致病菌是導(dǎo)致乳房炎的主要因素，國內(nèi)外很多學(xué)者就導(dǎo)致牛乳房炎的致病菌種類進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：引起乳房炎的病原微生物多達(dá)150多種，但最常見的約有20多種，其中主要以無乳鏈球菌為主，其次是停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等[9]?，F(xiàn)在治療乳房炎一般均采用抗菌藥特別是抗生素乳房內(nèi)灌注方法，抗生素不僅能引起病原微生物產(chǎn)生耐藥性[10]，使通過抗生素治療乳房炎的難度越來越大，更重要的是造成了抗生素在牛奶中大量殘留，從而引起食用者產(chǎn)生過敏反應(yīng)、皮疹、哮喘、休克甚至死亡[11]。近年來，國外有很多學(xué)者對乳酸菌治療乳房炎進(jìn)行了研究，乳酸菌是益生菌的重要組成部分，它不僅能在人體腸道等重要部位發(fā)揮益生功能[12-13]，而且不會讓致病菌產(chǎn)生耐藥性，安全性高，這主要是因?yàn)槿樗峋a(chǎn)生的H2O2[14]，有機(jī)酸，如乙酸、丙酸、乳酸等[15]和抗生素或細(xì)菌素類物質(zhì)具有較強(qiáng)的殺菌作用[16-18]。所以本文以乳酸菌的抑菌作用為理論基礎(chǔ)，研究6株嗜酸乳桿菌及其代謝產(chǎn)物中的抑菌成分：細(xì)菌素、H2O2、有機(jī)酸分別對導(dǎo)致牛乳房炎的4株主要致病菌：無乳鏈球菌、乳房鏈球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果，從而得出6株乳酸菌的各種代謝產(chǎn)物對各致病菌的抑菌活力，以及各乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素和H2O2在何種環(huán)境下才能更好的發(fā)揮抑菌作用，為將來用乳酸菌的抑菌代謝產(chǎn)物治療牛乳房炎，乃至適當(dāng)取代抗生素和治療更多由致病菌引起的疾病奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 嗜酸乳桿菌KLDS L2、KLDS L6、KLDS AD1、KLDS AD2、KLDS AD3和NCFM；無乳鏈球菌ATCC 13813、乳房鏈球菌、大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳品工業(yè)微生物菌種保藏中心（KLDSDICC）；THB培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，牛肉粉10g/L、胰蛋白胨20g/L、葡萄糖2g/L、碳酸氫鈉2g/L、氯化鈉2g/L、磷酸氫二鉀0.4g/L；MRS肉湯培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，酪蛋白酶消化物10g/L、牛肉膏粉10g/L、酵母膏粉4g/L、檸檬酸三銨2g/L、乙酸鈉5g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.05g/L、磷酸氫二鉀2g/L、葡萄糖20g/L、吐溫-80 1.08g/L；LB培養(yǎng)基 胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L；固體培養(yǎng)基 添加2%瓊脂；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司。

UV-2401PC紫外分光光度計(jì) 日本島津。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 16S rDNA菌種的鑒定和致病菌的生長曲線的制備 對無乳鏈球菌ATCC 13813（編號M1，下同）、乳房鏈球菌（M2）、大腸桿菌ATCC 25922（M3）、金黃色葡萄球菌ATCC 25923（M4）4株菌種進(jìn)行16SrDNA鑒定，防止菌種出現(xiàn)誤差。

將M1、M2分別接種在THB液體培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)，每隔1h取樣，將M3、M4分別接種在LB液體培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)，每隔3h取樣，都在600nm下測OD值，然后以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)做出各個(gè)致病菌的生長曲線圖。最后根據(jù)生長曲線，取穩(wěn)定期的菌株進(jìn)行稀釋平板計(jì)數(shù)。

1.2.2 乳酸菌酸度曲線的描繪 將6株乳酸菌按照2%接種量分別接種在MRS液體培養(yǎng)基中，每4h取樣滴定酸度，測發(fā)酵液的pH，最后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，pH為縱坐標(biāo)描繪乳酸菌的酸度曲線圖。

1.2.3 乳酸菌無細(xì)胞上清液的制備和各上清液抑菌能力的研究 將6株嗜酸乳桿菌KLDS L2、KLDS L6、KLDS AD1、KLDS AD2、KLDS AD3和NCFM分別編號為H2、H3、H4、H5、H6、H7，分別接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，10000g，4℃條件下離心20min，再用0.22μm的濾膜過濾得到乳酸菌無細(xì)胞上清液[19]。

將500μL的105CFU/mL致病菌的稀釋液涂布在各自最適固體培養(yǎng)基上，水平放置在4℃冰箱中12h，使培養(yǎng)基完全吸收掉稀釋液，然后進(jìn)行牛津杯抑菌實(shí)驗(yàn)，在牛津杯中注入200μL的乳酸菌無細(xì)胞發(fā)酵上清液，每組3個(gè)平行，最后將其放在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8h，觀察此牛津杯瓊脂擴(kuò)散抑菌實(shí)驗(yàn)是否產(chǎn)生抑菌圈[20]，并用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑（減去牛津杯直徑），得到數(shù)據(jù)，做出柱狀圖，由此判斷各乳酸菌對各致病菌的抑菌性強(qiáng)弱。

1.2.4 溫度對乳酸菌無細(xì)胞上清液的影響 將乳酸菌無細(xì)胞上清液在80℃條件下水浴15min，然后用牛津杯法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)（方法同1.2.3）。并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與1.2.3各菌株原上清液的抑菌數(shù)據(jù)比較，做出柱狀圖，確定溫度對上清液中抑菌活性物質(zhì)的影響。

1.2.5 H2O2酶對乳酸菌無細(xì)胞上清液抑菌性的影響向上清液中加入H2O2酶，使其終濃度達(dá)到1mg/mL，在37℃條件下溫浴2h，用此上清液做抑菌實(shí)驗(yàn)（方法同1.2.3），并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與1.2.3各菌株原上清液的抑菌數(shù)據(jù)比較，做出柱狀圖，確定上清液中H2O2的抑菌效果。

1.2.6 胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K對乳酸菌無細(xì)胞上清液的影響 在乳酸菌無細(xì)胞上清液中依次加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K干粉，使各蛋白酶的終濃度達(dá)到1mg/mL，然后在37℃條件下溫浴2h，做抑菌實(shí)驗(yàn)（方法同1.2.3），并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與1.2.3各菌株原上清液的抑菌數(shù)據(jù)比較，確定上清液中細(xì)菌素類物質(zhì)的抑菌效果。

1.2.7 不同pH條件對乳酸菌無細(xì)胞上清液中抑菌活性物質(zhì)的影響 用高濃度的乳酸和NaOH溶液將各上清液的pH調(diào)節(jié)為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，最后用牛津法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)（方法同1.2.3），確定不同pH對上清液中抑菌活性物質(zhì)的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 16S rDNA菌種鑒定結(jié)果和致病菌生長曲線

圖1 4株致病菌生長曲線Fig.1 The growth curve of 4 strains of pathogenic bacteria

16S rDNA菌種鑒定結(jié)果表明，各菌株為編號所對應(yīng)的菌株，菌種無差錯(cuò)。如圖1所示為M1、M2、M3、M4這4株致病菌的生長曲線圖，可見，M1、M2開始生長迅速，但由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，代謝產(chǎn)物的積累等負(fù)面因素的影響，最終在5h左右時(shí)達(dá)到最大OD值1.50左右，到達(dá)穩(wěn)定期，同理，M3、M4在18h左右達(dá)到最大OD值1.10左右，到達(dá)穩(wěn)定期，所以分別在此時(shí)間點(diǎn)取樣進(jìn)行稀釋涂布計(jì)數(shù)，結(jié)果表明，M1、M2能達(dá)到3.0×108CFU/mL，M3、M4達(dá)到2.1×107CFU/mL。

2.2 乳酸菌酸度曲線描繪

圖2 6株乳酸菌的酸度曲線圖Fig.2 The acidity curve of 6 strains of lactic acid bacteria

6株嗜酸乳桿菌的酸度曲線圖如圖2所示，可見6株菌基本隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，培養(yǎng)基中的糖被乳酸菌分解成為有機(jī)酸，從而使pH不斷降低，基本都在24h后達(dá)到最低pH，但H6、H4、H7最終pH較低，其中H7最低，達(dá)到了3.50。

2.3 各乳酸菌上清液抑菌能力

如圖3（a）所示，各乳酸菌上清液對M1抑菌活性大小：H7＞H3＞H6＞H4＞H5＞H2；同理，圖3（b）表明，在抑制M2方面，抑菌活性大?。篐7＞H4＞H6＞H3＞H2＞H5；圖3（c）表明，在抑制M3方面，抑菌活性大?。篐7＞H3＞H6＞H5＞H4＞H2；圖3（d）表明，在抑制M4方面，抑菌活性大?。篐7＞H2＞H6＞H5＞H4＞H3。影響上清液抑菌活性的物質(zhì)主要是有機(jī)酸、細(xì)菌素和H2O2，所以以上上清液的抑菌活性是三種抑菌物質(zhì)共同作用的結(jié)果，綜合而言，H7對4株致病菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑都達(dá)到a、b、c、d的最大值，特別是對M3和M4效果最顯著，數(shù)值分別達(dá)到14.13mm和12.76mm，H6對4株致病菌的抑制效果良好，結(jié)合實(shí)驗(yàn)1.2.2，這可能與H7、H6較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力有關(guān)，同時(shí)，6株乳酸菌普遍都對M4的抑制效果顯著，抑菌圈直徑都基本超過9.00mm。

圖3 6株乳酸菌上清液對4株致病菌抑菌效果Fig.3 The inhibitory effect of 6 strains of lactic acid bacteria supernatant fluid on 4 strains of pathogenic bacteria

2.4 溫度對乳酸菌上清液抑菌能力影響

經(jīng)高溫處理之后的上清液對各致病菌的抑菌效果如圖4中的h2～h7（編號為：H2～H7的嗜酸乳桿菌經(jīng)處理后在圖中標(biāo)示為：h2～h7以方便區(qū)分，圖4～圖6同）所示，將這些柱狀圖與圖3進(jìn)行對比，得到圖4。

圖4（a）表明，高溫處理對各乳酸菌上清液抑菌活性（M1）影響大?。篐5＞H6＞H4＞H3＞H7＞H2；同理，圖4（b）表明，高溫處理對各乳酸菌上清液抑菌活性（M2）影響大?。篐4＞H2＞H5＞H7＞H3＞H6；圖4（c）表明高溫處理對各乳酸菌上清液抑菌活性（M3）影響大小：H5＞H7＞H4＞H2＞H3=H6；圖4（d）表明，高溫處理對各乳酸菌上清液抑菌活性（M4）影響大?。篐5＞H4＞H6＞H3＞H2＞H7。綜上所述，高溫對H5上清液的抑菌活性影響最大，處理后的H5的抑菌圈直徑縮小值在a、c、d中都達(dá)到最大，在b中也達(dá)到0.50mm，但處理后的H3在a、b、c中對各致病菌抑菌圈直徑影響較小，分別為0.19、0.20、0.26mm，這可能主要是由于H5、H3抑菌活性產(chǎn)物分別熱敏性較高和耐熱力較強(qiáng)的緣故。

圖4 高溫處理的6株乳酸菌上清液對4株致病菌的影響Fig.4 The effect of 6 strains of lactic acid bacteria supernatant fluid processed by high-temperature on 4 strains of pathogenic bacteria

2.5 H2O2酶對乳酸菌上清液抑菌性影響

經(jīng)H2O2酶處理之后的上清液對各致病菌的抑菌效果如圖5中的h2～h7所示，將這些柱狀圖與圖3進(jìn)行對比，得到圖5。

圖5 H2O2酶處理的6株乳酸菌上清液對4株致病菌的影響Fig.5 The effect of 6 strains of lactic acid bacteria supernatant fluid processed by H2O2enzyme on 4 strains of pathogenic bacteria

如圖5（a）所示，H2O2酶處理對各乳酸菌上清液抑菌活性（M1）影響大?。篐4＞H6＞H5＞H3＞H2＞H7；同理，圖5（b）表明，H2O2酶處理對各乳酸菌上清液抑菌活性（M2）影響大?。篐7＞H3＞H4＞H5＞H6＞H2；圖5（c）表明，H2O2酶處理對各乳酸菌上清液抑菌活性（M3）影響大?。篐3＞H7＞H5＞H6＞H4＞H2；圖5（d）表明，H2O2酶處理對各乳酸菌上清液抑菌活性（M4）影響大?。篐6＞H3＞H2＞H4＞H7＞H5。由圖5可見，6株乳酸菌經(jīng)過H2O2酶處理之后，抑菌活性都降低了，這是由于乳酸菌產(chǎn)生的具有抑菌作用的代謝產(chǎn)物H2O2被H2O2酶分解的緣故，可以通過此方法鑒定各乳酸菌產(chǎn)H2O2能力，以及H2O2對不同致病菌的殺菌能力，上述結(jié)果表明：處理后的H3對M2、M3、M4抑菌圈直徑分別降低了2.20、6.47、1.46mm，在b、c、d中抑菌活性降低程度很大，但其他乳酸菌產(chǎn)生的H2O2對4株致病菌的抑菌活力差異性較大，這可能是由于不同乳酸菌產(chǎn)生的H2O2量不同，同時(shí)H2O2對不同致病菌具有不同抑制性的緣故。

2.6 胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K對乳酸菌上清液影響

經(jīng)各種蛋白酶處理之后的上清液對各致病菌的抑菌效果如圖6中的h2～h7所示，將這些柱狀圖與圖3進(jìn)行對比，得到圖6。

如圖6（a）表明，蛋白酶處理對各乳酸菌上清液抑菌活性（M1）影響大?。篐6＞H4＞H2＞H3＞H5＞H7；同理，圖6（b）表明，蛋白酶處理對各乳酸菌上清液抑菌活性（M2）影響大?。篐3＞H5＞H4＞H7＞H6＞H2；圖6（c）表明，蛋白酶處理對各乳酸菌上清液抑菌活性（M3）影響大?。篐3＞H7＞H5＞H6＞H2＞H4；圖6（d）表明，蛋白酶處理對各乳酸菌上清液抑菌活性（M4）影響大?。篐5＞H6＞H2＞H7＞H3＞H4。經(jīng)過各種蛋白酶處理的上清液的抑菌活性都明顯降低，這是由于乳酸菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)類細(xì)菌素代謝產(chǎn)物被蛋白酶分解的緣故，所以，可以通過此方法鑒定乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素量。綜合而言，處理后的H3對M2、M3的抑菌圈直徑縮小值分別為1.62、3.47mm，在b、c中都為最大值；處理后的H5對M2、M4的抑菌圈直徑縮小值分別為1.33、1.58mm，在b、d中抑菌活性降低程度很大，圖6也充分說明同一株乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素對不同的致病菌抑菌性有明顯的差異，可見在利用細(xì)菌素治療乳房炎之前對其致病菌進(jìn)行鑒定，然后進(jìn)行有針對性的治療。

圖6 蛋白酶處理的6株乳酸菌上清液對4株致病菌的影響Fig.6 The effect of 6 strains of lactic acid bacteria supernatant fluid processed by protease on 4 strains of pathogenic bacteria

2.7 不同pH條件對乳酸菌上清液中抑菌活性物質(zhì)的影響

H2～H7的上清液經(jīng)在不同pH條件下對4種致病菌的抑菌效果圖7～圖10所示：隨著pH不斷降低，上清液的抑菌能力不斷增強(qiáng)，特別是當(dāng)pH≤3.5左右時(shí)，隨著pH降低，各乳酸菌上清液抑菌能力增幅較大，可見pH對上清液的抑菌能力影響很大；但當(dāng)pH≥5時(shí)，H2和H4的上清液對部分致病菌已無抑菌性。同時(shí)只有H3、H5、H6、H7在pH=6.0、7.0時(shí)，還具有一定的抑菌能力，這說明各菌產(chǎn)生的細(xì)菌素和H2O2在酸性環(huán)境下才能更好的發(fā)揮抑菌作用。

圖7 不同pH條件下6株乳酸菌上清液對M1抑制效果Fig.7 The inhibitory effect of 6 strains of lactic acid bacteria supernatant fluid on M1 in different pH conditions

圖8 不同pH條件下6株乳酸菌上清液對M2抑制效果Fig.8 The inhibitory effect of 6 strains of lactic acid bacteria supernatant fluid on M2 in different pH conditions

圖9 不同pH條件下6株乳酸菌上清液對M3抑制效果Fig.9 The inhibitory effect of 6 strains of lactic acid bacteria supernatant fluid on M3 in different pH conditions

圖10 不同pH條件下6株乳酸菌上清液對M4抑制效果Fig.10 The inhibitory effect of 6 strains of lactic acid bacteria supernatant fluid on M4 in different pH conditions

3 結(jié)論

3.1 由于造成乳房炎的致病菌以及不同乳酸菌分泌的抑菌物質(zhì)對同一株致病菌抑制作用都存在差異，所以以各株致病菌為標(biāo)準(zhǔn)，分析不同上清液對同一株致病菌的影響。結(jié)果表明，6株嗜酸乳桿菌都能對4株導(dǎo)致牛乳房炎的致病菌特別是金黃色葡萄球菌起到明顯的抑制效果，其中NCFM（H7）對4株致病菌抑制效果最好，KLDS AD3（H6）良好，又由于這兩株菌產(chǎn)生的細(xì)菌素和H2O2抑菌活力一般，結(jié)合酸度曲線圖，所以這與二者具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力有重要關(guān)系。

3.2 KLDS AD3（H6）細(xì)菌素對M1無乳鏈球菌抑菌效果最好；KLDS AD2（H5）細(xì)菌素對M4金黃色葡萄球菌抑制效果最好，同時(shí)，KLDS AD2（H5）的抑菌代謝產(chǎn)物熱敏性最高；KLDS L6（H3）細(xì)菌素類物質(zhì)對M2乳房鏈球菌、M3大腸桿菌抑菌效果最好，且其抑菌活性物質(zhì)耐熱能力較強(qiáng)，保持適當(dāng)?shù)乃嵝原h(huán)境有利于提高抑菌活性物質(zhì)的抑菌能力。

3.3 由于不同地區(qū)，不同環(huán)境，造成牛乳房炎的致病菌種類存在差異性，所以治療之前鑒定出主要的致病菌，然后篩選出對特定致病菌抑制效果較好的乳酸菌上清液或單一的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行治療，將會使治療更加具有針對性，從而達(dá)到更好的治療效果。

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