潘 龍，谷文英

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

硝普鈉浸種對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

潘 龍1，2，谷文英2

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

通過(guò)不同濃度的外源一氧化氮(NO)供體硝普鈉(Sodium Nitropprusside，SNP)對(duì)紫花苜蓿(Medicagosativa)種子進(jìn)行處理，研究其對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)、幼苗胚根與胚軸生長(zhǎng)、MDA含量及POD活性的影響。結(jié)果表明，與不處理對(duì)照組相比，低濃度SNP(50～100 μmol·L-1)組的紫花苜蓿種子發(fā)芽率最高，為對(duì)照組的121%。幼苗胚根與胚軸的長(zhǎng)分別是對(duì)照組的139%和145%，均顯著高于對(duì)照組(Plt;0.05)；幼苗POD酶的活性也顯著提高，MDA的含量?jī)H為對(duì)照組的35%，顯著低于對(duì)照組(Plt;0.05)。但較高濃度的SNP(gt;100 μmol·L-1)浸種，其發(fā)芽率降低，與對(duì)照組差異不顯著(Pgt;0.05)。胚根與胚軸增長(zhǎng)趨勢(shì)也變緩；幼苗POD酶活性增長(zhǎng)速度也明顯降低，MDA含量有所增加，但仍低于對(duì)照組。SNP浸種能促進(jìn)紫花苜蓿種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)，提高幼苗POD酶的活性，降低MDA的含量，其適宜濃度為50～100 μmol·L-1。

一氧化氮；種子萌發(fā)；幼苗生長(zhǎng)

紫花苜蓿(Medicagosativa)屬于豆科多年生優(yōu)質(zhì)牧草，是常見(jiàn)牧草中營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高的一種，蛋白含量高達(dá)20%左右，被譽(yù)為“牧草之王”[1-2]，但紫花苜蓿種子的萌發(fā)常受到氣候、土壤等因素的影響，許多種子不能有效利用，主要表現(xiàn)為種子發(fā)芽率不高，幼苗抗逆性不強(qiáng)，一定程度上制約著紫花苜蓿種植的推廣，影響苜蓿草產(chǎn)量。

一氧化氮(NO)是分布于生物體內(nèi)一種特殊的氣體類生物活性分子，植物體可以產(chǎn)生內(nèi)源性的NO[3]。NO在細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定，具有自由基性質(zhì)，常以一氧化氮自由基(NO·)、亞硝酰陽(yáng)離子(NO+)和亞硝酰陰離子(NO-)3種生物學(xué)效應(yīng)形式存在[4]。Corpas等[5]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性的NO在植物體內(nèi)可以作為植物抗病反應(yīng)的信號(hào)分子，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)生理過(guò)程，如種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、防御基因的表達(dá)以及耐逆反應(yīng)等；且NO有脂溶性，很容易穿透生物膜，利于影響與產(chǎn)生NO細(xì)胞相鄰近的細(xì)胞[6]。但NO具有毒害和保護(hù)細(xì)胞的雙重生理效應(yīng)[7]，這與植物細(xì)胞的生理?xiàng)l件狀況和NO有效濃度有關(guān)[8]。

目前，關(guān)于提高紫花苜蓿的抗逆性研究已經(jīng)受到重視，得到一些研究結(jié)果。如，沙引發(fā)處理能提高紫花苜蓿種子活力和抗鹽脅迫能力[9]；NO能緩解干旱脅迫造成的氧化損傷，提高苜蓿葉片葉綠素含量和光合作用能力，增強(qiáng)苜蓿的抗旱性[10]。關(guān)于外源NO對(duì)經(jīng)濟(jì)作物種子萌發(fā)影響的研究更受到廣泛關(guān)注，如張少穎等[11]研究發(fā)現(xiàn)，硝普鈉(SNP)浸種可以提高玉米(Zeamays)種子的發(fā)芽率，促進(jìn)幼苗地上部和根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，且利于玉米側(cè)根的發(fā)芽，幼苗葉片中硝酸還原酶活性也得到提高；劉開(kāi)力等[12]研究表明，SNP浸種可以提高鹽脅迫下水稻(Oryzasativa)的耐鹽比率，對(duì)鹽脅迫下的幼苗生長(zhǎng)有一定的緩解作用；張黛靜等[13]試驗(yàn)證明，NO能夠直接調(diào)節(jié)小麥(Triticumaestivum)生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老等生理作用，而且可以參與小麥對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答；段培等[14]研究發(fā)現(xiàn)，SNP浸種預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下的小麥葉片氧化損傷有明顯的緩解作用，同時(shí)能顯著誘導(dǎo)鹽脅迫下小麥葉片SOD、CAT、APX酶的活性，從而減輕鹽脅迫下小麥葉片的氧化損傷；肖強(qiáng)和鄭海雷[15]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，較低鹽度海水可以作為植物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)液，促進(jìn)小白菜(Brassicachinensis)種子萌發(fā)，外加0.01 mmol·L-1SNP能夠提高小白菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)。

但關(guān)于外源NO對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)影響的研究報(bào)道較少，本試驗(yàn)探究外源NO對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響，以期提高紫花苜蓿種子萌發(fā)率和幼苗的成活率，高效生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的苜蓿草。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 供試紫花苜蓿種子來(lái)源于揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)牧場(chǎng)，腎形，黃褐色，千粒重2.0 g，發(fā)芽率≥80%；外源NO供體采用SNP(分析純)，500 μmol·L-1的SNP約能產(chǎn)生2.0 μmol·L-1的NO[16]；人工環(huán)境控制培養(yǎng)箱，超凈臺(tái)，高壓滅菌鍋等。

1.2種子處理 將SNP濃度設(shè)為7個(gè)水平，分別為0、10、25、50、100、250、500 μmol·L-1，其中0為對(duì)照組，以蒸餾水代替SNP溶液。不同濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

挑選飽滿程度和大小接近的種子，用砂紙輕輕摩擦種皮，再將擦破皮的種子包裹在沙布中，用去離子水反復(fù)沖洗，然后用濾紙吸干水分[17]；將種子均勻擺放在鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入8 mL的各濃度SNP處理液[18]，置于室內(nèi)人工培養(yǎng)箱中，溫度為24 ℃，濕度為70% ，每天12 h光照條件下進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)。

1.3種子觀察與記錄 以胚根突破種皮1 mm視為發(fā)芽[9]，每天在規(guī)定的時(shí)間記錄種子發(fā)芽情況，3 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，7 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，計(jì)算發(fā)芽指數(shù)(GI)和活力指數(shù)(VI);種子萌發(fā)第8天至第9天分別測(cè)定幼苗胚軸、胚根長(zhǎng)度及鮮質(zhì)量。

GI=∑(Gt/Dt)；VI=GI×S.

式中，Gt為在t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)，S為胚軸長(zhǎng)度。

1.4生理生化指標(biāo)測(cè)定 種子萌發(fā)第8天至第9天分別測(cè)量幼苗胚根、胚軸MDA含量、POD的相對(duì)活性。MDA含量使用硫代巴比妥酸反應(yīng)法測(cè)定，POD 活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，以每分鐘內(nèi)OD470變化0.01為1 個(gè)酶活力單位，計(jì)算酶活性[19-23]。

1.5數(shù)據(jù)處理 所測(cè)的數(shù)據(jù)用Excel處理后，采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1SNP對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響 SNP濃度在0～100 μmol·L-1范圍內(nèi)，種子發(fā)芽率由81%增加到98%，發(fā)芽率為對(duì)照組的121%，差異顯著(Plt;0.05)，但當(dāng)SNP濃度繼續(xù)增高時(shí)，發(fā)芽率轉(zhuǎn)而開(kāi)始降低，當(dāng)SNP濃度為500 μmol·L-1時(shí)，發(fā)芽率降到80%，與對(duì)照組差異不顯著(Pgt;0.05)；當(dāng)SNP濃度為100 μmol·L-1時(shí)發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)達(dá)到最大，分別為對(duì)照的156%、148%，與對(duì)照組相比差異顯著，當(dāng)SNP濃度繼續(xù)增大時(shí)，發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)也開(kāi)始降低，當(dāng)SNP濃度達(dá)到500 μmol·L-1時(shí)，發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)分別降到65.56%、26.40，但仍高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的118%、110%；苜蓿種子活力指數(shù)在SNP濃度為50 μmol·L-1時(shí)達(dá)到最大，為對(duì)照組的202%，差異顯著，但當(dāng)SNP濃度繼續(xù)增大時(shí)，活力指數(shù)開(kāi)始降低，當(dāng)SNP濃度為500 μmol·L-1時(shí)，活力指數(shù)降到49.28，與對(duì)照差異不顯著(表1)。因此，當(dāng)SNP濃度在50～100 μmol·L-1時(shí)，種子的發(fā)芽情況最優(yōu)。

表1 SNP對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of SNP on germination of alfalfa seed

注：同列不同字母表示在0.05水平上的差異顯著(LSD法)。下表同。

Note:Different letters in the same column mean significant difference among the treatments at 0.05 level. The same below.

2.2SNP對(duì)紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響 紫花苜蓿幼苗的胚根、胚軸長(zhǎng)及鮮質(zhì)量隨SNP濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)SNP濃度為50 μmol·L-1時(shí)幼苗的胚根、胚軸長(zhǎng)及鮮質(zhì)量達(dá)到最大，分別為對(duì)照組的139%、145%、143%，顯著高于對(duì)照組(Plt;0.05)。當(dāng)SNP濃度繼續(xù)增加時(shí)，幼苗的胚根、胚軸長(zhǎng)及鮮質(zhì)量有所下降但仍高于對(duì)照組，當(dāng)SNP濃度達(dá)到500 μmol·L-1，胚根、胚軸長(zhǎng)均為對(duì)照組的118%，與對(duì)照組相比差異顯著(表2)。由此說(shuō)明，低濃度SNP(50～100 μmol·L-1)對(duì)苜蓿幼苗胚根、胚軸及鮮質(zhì)量的增長(zhǎng)有促進(jìn)作用，而較高濃度SNP(gt;100 μmol·L-1)的作用不明顯。

表2 SNP對(duì)紫花苜蓿胚根和胚軸生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of SNP on growth of radical and hypocotyls of alfalfa seedling

2.3SNP對(duì)紫花苜蓿幼苗丙MDA含量的影響 MDA含量隨SNP濃度增加呈先降低后升高的趨勢(shì)，當(dāng)SNP濃度為100 μmol·L-1時(shí)，MDA的含量最低，為對(duì)照組的35%，差異極顯著(Plt;0.01)(圖1)。但隨著SNP濃度的繼續(xù)增加，MDA的含量又有增加的趨勢(shì)，當(dāng)SNP濃度為500μmol·L-1時(shí)MDA的含量增加到22.55×10-3μmol·L-1，但仍低于對(duì)照組，為對(duì)照組的71%(Plt;0.05)。因此，適當(dāng)?shù)腟NP濃度(50～100 μmol·L-1)可以降低苜蓿幼苗的膜脂過(guò)氧化水平，高濃度(gt;100 μmol·L-1)可能造成膜的傷害。

圖1SNP對(duì)紫花苜蓿幼苗MDA含量的影響
Fig.1EffectsofSNPonMDAcontentofalfalfaseedling

注：不同字母表示不同濃度間差異顯著(Plt;0.05)。下圖同。

Note：Different lower case letters mean significant difference among treatments at 0.05 level.The same below.

2.4SNP對(duì)紫花苜蓿幼苗POD活性的影響 POD活性隨SNP濃度的增加而增加，當(dāng)SNP濃度為100 μmol·L-1時(shí)，POD活性為對(duì)照組的165%，差異極顯著(Plt;0.01)，但當(dāng)SNP濃度繼續(xù)增大時(shí)POD活性增加速度變緩，當(dāng)達(dá)到500 μmol·L-1時(shí)，POD活性為330.8 U·min-1·g-1，與100 μmol·L-1的POD活性差異不顯著(Pgt;0.05)(圖2)。

圖2 SNP對(duì)紫花苜蓿幼苗POD活性的影響Fig.2 Effects of SNP on POD activity of alfalfa

3 討論與結(jié)論

本研究表明，適當(dāng)?shù)腟NP濃度(50～100 μmol·L-1)能顯著改善紫花苜蓿種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)，提高幼苗POD酶的活性，降低MDA的含量；但是較高的SNP濃度(gt;100 μmol·L-1)卻有相反的趨勢(shì)。該結(jié)論與陳世軍等[24-25]在辣椒(Capsicumannuum)種子上的研究基本一致，低濃度的SNP(75或100 μmol·L-1)能顯著提高辣椒種子的萌發(fā)率和抗逆性，但較高濃度的SNP處理，作用相反。與汪妮[26]研究SNP對(duì)谷子(Pennisetumglaucum)幼苗的抗氧化酶活性及MDA含量的影響也相一致，即隨著SNP濃度的增加，谷子種子萌發(fā)幼苗的POD酶活性變化呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)；幼苗的MDA含量則先降低后升高。

植物體內(nèi)都會(huì)產(chǎn)生活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)，正常情況下自由基處于動(dòng)態(tài)平衡中，但受到脅迫時(shí)自由基就會(huì)升高，引起生理生化反應(yīng)。ROS能與體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)、脂類等生物大分子反應(yīng)，使DNA、蛋白質(zhì)變性及脂質(zhì)過(guò)氧化，降低酶活性、增大膜透性[27]和致基因突變[28]，抑制植物生長(zhǎng)。MDA是自由基導(dǎo)致膜質(zhì)過(guò)氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映膜損傷的程度[29-30]。 MDA積累過(guò)多，預(yù)示自由基處于高水平，反映植物遭受逆境程度較高[31]。本研究中，低濃度的SNP(0～100 μmol·L-1)能顯著降低紫花苜蓿幼苗MDA的含量，而高濃度SNP(gt;100 μmol·L-1)則有增加趨勢(shì)，與汪妮[26]對(duì)谷子種子萌發(fā)后幼苗的MDA含量在0～100 μmol·L-1范圍內(nèi)與SNP濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，在100～500 μmol·L-1范圍內(nèi)呈顯著正相關(guān)，其中100 μmol·L-1時(shí)MDA含量最低，為對(duì)照的79.3%的研究結(jié)論基本一致。

POD則是植物體對(duì)細(xì)胞膜保護(hù)的一種抗氧化酶，能有效清除體內(nèi)多余ROS，其活性的高低反映植物清除ROS的能力。POD活性隨SNP濃度的增加而增加，雖然當(dāng)SNP濃度gt;100 μmol·L-1時(shí)，POD增長(zhǎng)速度變慢，但是當(dāng)SNP濃度為 500 μmol·L-1時(shí)，POD活性最大，為對(duì)照組的173.9%，這表明SNP浸種能誘導(dǎo)POD活性，致使ROS減少，避免核酸、蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)過(guò)氧化，從而促進(jìn)種子萌發(fā)。陳世軍和張明生[25]研究證明，NO可以通過(guò)順烏頭酸、cGMP途徑以及與H2O2、水楊酸等信號(hào)分子或與抗氧化酶類相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS的代謝。

本研究中，NO對(duì)苜蓿種子萌發(fā)的影響總體上與前人“低促高抑”的研究結(jié)果[32]基本一致，但關(guān)于其影響機(jī)制報(bào)道不一，Guerin等[33]認(rèn)為NO可以提高α-淀粉酶活性、加速胚乳淀粉的降解；張華等[34]認(rèn)為NO可以提高種子的通透性，利于水分的滲入；Leshem和Hamaraty[35]則認(rèn)為NO可以直接作用于細(xì)胞壁組成，使細(xì)胞壁松弛，以及NO作用于磷脂膜的脂質(zhì)雙分子層，增強(qiáng)膜的流動(dòng)性。NO緩解膜脂過(guò)氧化、提高保護(hù)酶系統(tǒng)，可能是由于NO對(duì)含鐵相關(guān)酶類有很高的親和性，調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫酶、抗壞血酸過(guò)氧化物酶和細(xì)胞色素C氧化酶等酶類活性參與植物生理反應(yīng)。

NO對(duì)植物的生長(zhǎng)具有如此奇妙的作用，但由于植物體在一定的環(huán)境條件下可以產(chǎn)生內(nèi)源性NO，同時(shí)NO也與植物體內(nèi)的激素有著密切的復(fù)雜聯(lián)系[36-37]，所以NO對(duì)植物體的生理調(diào)節(jié)功能和信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。只有揭示NO對(duì)植物體的調(diào)節(jié)機(jī)制，才能深入研究外源NO對(duì)植物的生理效應(yīng)。

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EffectsofsoakingseedsinSNPonseedgerminationandseedlinggrowthofalfalfa

PAN Long1,2, GU Wen-ying2

(1.Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2.Animal Science amp; Technology, Yanzhou Unversity, Yanzhou 225009, China)

Effects of soaking seeds in sodium nitropprusside (SNP) on seed germination and seedling growth of alfalfa were studied. The results showed that， 1) seed germination rate and growth of radical and hypocotyls of soaking in 50-100 μmol·L-1SNP treatments were significantly higher than those in control, and they were up to 1.21,1.39 and 1.45 times as control, respectively; 2) The activity of POD in seedling was enhanced significantly, and MDA content in seedling was decreased to 35%, and significantly lower than those in the control group. For the seeds soaking in SNP with high concentration (gt;100 μmol·L-1), the germination rate began to drop and had no significantly different with control. At the same time, the trend of growth of radical and hypocotyls was slowing down. MDA content was increasing, but still lower than that in control, while the activity of POD was reducing significantly. In conclusion, alfalfa seed soaking in SNP can promote alfalfa seed germination and seedling growth, improve seedling POD activity and reduce content of MDA. The appropriate concentration is 50-100 μmol·L-1.

carbon monoxide; seed germination; seedling growth

GU Wen-ying E-mail：yligu@yahoo.com.cn

2012-04-21接受日期：2012-09-05

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(SJ2011092506)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)牧草產(chǎn)業(yè)體系資金(Z09090501040902)

潘龍(1988-)，男，江蘇邳州人，在讀碩士生，研究方向?yàn)榉雌c動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)。E-mail:panlong8809@163.com

谷文英(1969-)，女，河南衛(wèi)輝人，講師，在讀博士生，主要從事牧草栽培與組織培養(yǎng)方面的教學(xué)與研究。E-mail：yligu@yahoo.com.cn

S816;S541+.104;Q945.3

A

1001-0629(2013)01-0058-05