張顯偉 曹 宏 田曉豐

1.吉林省遼源市中醫(yī)院外二科，吉林遼源 136200；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院外科，長春 130033

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。目前我國每年因HCC死亡的患者超過10萬人，約占世界HCC病死率的45%[1]。由于HCC起病隱匿，早期患者無明顯癥狀，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已多為中晚期并伴有嚴(yán)重的肝硬化，喪失了手術(shù)切除治療的機(jī)會。因此，對于中晚期HCC患者，肝動脈化療栓塞術(shù)（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）是目前首選的非手術(shù)治療方法[2]。雖然TACE能有效提高HCC患者的生存時間。然而，TACE術(shù)后HCC的復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移是影響其遠(yuǎn)期療效的最重要因素，且目前尚無有效預(yù)測TACE療效和預(yù)后的生物指標(biāo)[3]。miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類在真核生物中廣泛存在長度為20～25 nt的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA[4]。大量研究顯示，miRNA在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著非常重要的作用，且血液循環(huán)中腫瘤相關(guān)miRNAs還能作為診斷癌癥的生物學(xué)標(biāo)志[5-6]。最近的研究表明，miR-221在HCC患者癌組織和血清中的表達(dá)與HCC的發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)[7]。本研究通過檢測TACE治療前后HCC患者血清中miR-221表達(dá)水平的變化情況，探討血清miR-221能否成為判定HCC患者TACE治療的預(yù)后指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2009年3月～2012年6月在本院行TACE治療的58例HCC患者，另取32例健康體檢者血清樣本作為對照組。所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)檢測證實為HCC，診斷均符合2001年HCC臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)和臨床分期。入組標(biāo)準(zhǔn)：①病灶數(shù)≤3個，腫瘤最大直徑≤10 cm；②無肝內(nèi)、外轉(zhuǎn)移及無門靜脈癌栓形成；③肝功能分級為Child-Pugh A級或B級；④此前未接受過任何治療；⑤患者及其家屬被明確告知且簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol試劑、RNAisoTMPlus和實時熒光定量PCR試劑盒均購于日本Takara公司；Taq Man MicroRNA Assay和miRVanaTMmiRNA Isolation Kit購于美國Ambion公司。miR-221及U6引物序列購于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；電泳儀、DU-730紫外分光光度計和ABIPRISM 7900實時熒光定量PCR儀購于美國ABI公司。

1.3 肝動脈化療栓塞治療

患者常規(guī)術(shù)前準(zhǔn)備，經(jīng)皮股動脈穿刺成功，置入導(dǎo)管至腹腔動脈或肝動脈并行選擇性造影，明確腫瘤大小、位置和血管分布情況。微導(dǎo)管超選擇腫瘤供血動脈，將化療藥物阿霉素60 mg+奧沙利鉑50 mg+超液化碘化油混成乳劑緩慢灌注，最后用明膠海綿栓塞供瘤動脈血管。1.4實時熒光定量PCR檢測血清miR-221的表達(dá)

①血清的分離收集：所有患者均在TACE前1～5 d及術(shù)后1個月空腹采集靜脈血5 ml，將其置于室溫下1 h。然后4℃，3000 r/min條件下離心15 min，收集上清（血清）置于-80℃冰箱待測。②血清RNA的提?。翰捎肨rizol一步法提取血清中的總RNA，通過異丙醇法沉淀濃縮RNA，75%乙醇洗滌RNA沉淀。DU-730紫外分光光度計進(jìn)行RNA定量，1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。將提取出的RNA樣品保存于-80℃冰箱。③逆轉(zhuǎn)錄：按照TaqMan MicroRNAAssay的說明進(jìn)行操作。準(zhǔn)備25μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物：總 RNA 5 μl/Conc，100 mmol/LdNTPs（with dTTP）0.25 μl，Multiscribe 逆轉(zhuǎn)錄酶（50 U/μl）1.67 μl，10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 2.5 μl，RNA 水解酶抑制劑 （20 U/μl）0.32 μl，無RNA酶水 2.46μl，逆轉(zhuǎn)錄引物12.8μl。 在 Gene Amp PCR System 9700進(jìn)行 RT 反應(yīng)。 反應(yīng)條件：16℃，30 min；37℃，60 min；90℃，5 min。④實時熒光定量反應(yīng)：以U6為內(nèi)參基因，建立32μl反應(yīng)體系：TaqMan Universal PCR Master Mix 16 μl，20×TaqMan MicroRNA Assay mix 12.8 μl， 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5μl，無RNA酶水 0.7μl。 在ABI PRISM 7900實時熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：95°C，15 min；40個 PCR 循環(huán)（95℃，30 s；60℃，20 s；75℃， 20 s）。 數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法對 miR-221 表達(dá)進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組數(shù)據(jù)組間差異的分析采用配對t檢驗，Kaplan-Meier法計算平均疾病進(jìn)展時間（TTP）和中位生存期（MST），以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TACE術(shù)前血清miR-221表達(dá)與HCC臨床資料的比較

58例HCC患者血清miR-221的表達(dá)水平與臨床資料的關(guān)系見表1。HCC患者血清miR-221的表達(dá)水平在AFP、腫瘤大小、腫瘤分化程度及TNM分級方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與性別、年齡、肝硬化、Child-Pugh分級、腫瘤直徑和癌栓無明顯關(guān)系（P>0.05）。

表1 術(shù)前HCC患者血清miR-221表達(dá)水平與HCC臨床資料的比較（±s）

表1 術(shù)前HCC患者血清miR-221表達(dá)水平與HCC臨床資料的比較（±s）

臨床病理參數(shù) 例數(shù) miR-221 t值 P值性別0.126>0.05男女41 17 9.70±2.67 9.84±3.05年齡（歲）<60≥60腫瘤直徑（cm）≤5>5腫瘤分化高中分化低分化肝硬化0.364>0.05 39 19 9.82±2.71 9.66±2.87 0.457>0.05 36 22 9.43±3.08 10.26±3.27 3.677<0.05 38 20 7.84±2.79 13.20±5.77 0.483>0.05有無37 21 10.08±2.91 9.04±2.84 Child-Pugh A級B級術(shù)前AFP水平（μg/L）AFP<20 AFP≥20 TNM分期0.325>0.05 34 24 9.45±2.78 10.12±2.96 4.459<0.05 12 46 5.87±3.76 10.72±2.95 2.787<0.05ⅠⅡⅢ癌18 29 11 6.34±3.84 9.89±3.12 12.08±4.22栓有無0.307>0.05 16 42 10.69±3.66 9.34±2.72

2.2 TACE治療前后HCC患者血清miR-221表達(dá)的變化情況

HCC患者TACE術(shù)前血清miR-221的相對表達(dá)水平為 9.73±2.64，明顯高于健康對照組（1.69±0.53），TACE 術(shù)后1個月HCC患者血清miR-221的相對表達(dá)水平為3.85±1.17，較術(shù)前明顯降低（P<0.05）。

2.3 TACE術(shù)前血清miR-221的表達(dá)水平與患者TTP和MST的關(guān)系

按TACE術(shù)前HCC患者血清miR-221的平均相對表達(dá)水平9.73分組，將58例HCC患者分為miR-221高表達(dá)組（38例）和低表達(dá)組（20例）。高表達(dá)組TTP和MST分別為9.8個月和14.3個月，而低表達(dá)組TTP和MST分別為13.7個月和17.2個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖1，圖2）。

3 討論

目前非編碼的miRNA分子研究已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的熱門領(lǐng)域。隨著近年來對miRNA與腫瘤發(fā)生、發(fā)展之間關(guān)系研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)[8]，即miRNA在腫瘤的早期診斷和治療等方面表現(xiàn)出良好的潛能。因此，科學(xué)家們推測miRNA可能是一種理想的腫瘤檢測分子標(biāo)志及治療靶點[6，9]。

miR-221基因定位于X染色體p11.3區(qū)約1 kb的區(qū)域內(nèi)。近來研究表明，miR-221參與調(diào)控一系列生物進(jìn)程，如造血、血管生成、細(xì)胞增殖和凋亡等。此外，miR-221參與多種惡性腫瘤（如肝癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、黑色素瘤等）的發(fā)生，并在惡性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯上調(diào)，表現(xiàn)為一種“通用”的促癌基因[10-11]。其致癌機(jī)制可能 通 過 對 p27、GHR、HIF-1β、CDKN1C/p57、PUMA、Bmf、c-kit、DDIT4等癌基因的調(diào)控來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和增殖能力，抑制細(xì)胞分化和凋亡，從而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[12-13]。本研究采用RT-PCR檢測HCC患者血清miR-221表達(dá)情況以及TACE預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，TACE術(shù)前患者血清miR-221表達(dá)水平較健康對照組明顯升高。通過與HCC臨床病理因素分析顯示患者血清miR-221的表達(dá)水平在AFP、腫瘤大小、腫瘤分化程度及TNM分級方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與性別、年齡、肝硬化、Child-Pugh分級、腫瘤直徑和癌栓無明顯關(guān)系（P>0.05），提示血清miR-221與HCC的發(fā)生和疾病進(jìn)程存在一定的關(guān)聯(lián)，這與相關(guān)文獻(xiàn)的報道是一致的[7]。TACE術(shù)后患者血清miR-221表達(dá)水平出現(xiàn)大幅降低，提示miR-221參與了HCC發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控過程，也提示其可作為一個新的HCC診斷標(biāo)志物。根據(jù)血清miR-221表達(dá)平均水平對HCC患者進(jìn)行分組，結(jié)果顯示，低值組TTP和MST顯著高于高值組，說明血清miR-221在判斷HCC預(yù)后上也存在一定意義。然而，miR-221調(diào)控HCC進(jìn)程的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

總之，血清miR-221的檢測不僅可以作為HCC的早期診斷標(biāo)志物，也有利于對臨床上HCC患者判斷病情、及時治療及改善預(yù)后。

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