孟 康，郭 斌，王 冠

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧 錦 州 121001;2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

以往的研究對(duì)血管生成擬態(tài)(VM)隨時(shí)間和空間變化規(guī)律有了一定的認(rèn)識(shí)［1－2］，但對(duì)它與內(nèi)皮依賴(lài)性血管之間的關(guān)系和二者的演變過(guò)程沒(méi)有進(jìn)行深入細(xì)致的研究，尤其是在加入魟魚(yú)軟骨多糖(RCG)的條件下，對(duì)VM的研究少之又少。目前，我國(guó)在魟魚(yú)生理活性物質(zhì)的研究方面取得了一定進(jìn)展，從魟魚(yú)軟骨中提取、分離出具有抗腫瘤活性成分。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立C57小鼠黑色素瘤模型，觀察RCG對(duì)黑色素移植瘤的時(shí)空變化的影響及影響其變化的細(xì)胞因子CD31的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)RCG可抑制B16黑色素瘤的血管生成，且可能通過(guò)降低腫瘤細(xì)胞分泌細(xì)胞因子來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用，從而達(dá)到抑制腫瘤新生血管形成的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及給藥方法 清潔級(jí)C57BL/6小鼠(18～22)g，♂，60只，隨機(jī)分為5組:生理鹽水組(saline)、RCG 高劑量組(RCGH，900 mg·kg－1)、RCG 中劑量組(RCGM，300 mg·kg－1)、RCG 低劑量組(RCGL，100 mg·kg－1)、環(huán)磷酰胺(CTX)組(60 mg·kg－1)。黑色素瘤細(xì)胞株B16用RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。對(duì)每只小鼠右腋下注射0.2 ml的細(xì)胞懸液。各組接種后d 2開(kāi)始ip給藥，CTX組每周1次，其它各組每日1次。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表，每天抽取1只小鼠處死，共持續(xù)12 d。解剖并仔細(xì)檢查動(dòng)物全身，獲得腫瘤樣本。

1.2 免疫組織化學(xué)染色和CD31、PAS雙重染色 全部樣本均經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為0.10福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。免疫組織化學(xué)染色和CD31、PAS雙重染色進(jìn)行觀察，免疫組織化學(xué)染色操作步驟按SP法進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 首先利用計(jì)算機(jī)圖像處理軟件計(jì)算每張切片中壞死面積，在進(jìn)行中央?yún)^(qū)與外周區(qū)的劃分時(shí)，避開(kāi)腫瘤壞死，將每張切片中腫瘤組織平均分為3部分，占腫瘤組織內(nèi)約1/3部分為中央?yún)^(qū)，外1/3的部分即為外周區(qū)，其余為中間區(qū)域。把VM、內(nèi)皮依賴(lài)性血管為核心的高倍視野劃分為VM、內(nèi)皮依賴(lài)性血管附近，即中央?yún)^(qū);距離中央?yún)^(qū)一個(gè)高倍視野的腫瘤細(xì)胞即距離VM和內(nèi)皮依賴(lài)性血管較遠(yuǎn)的部分為外周區(qū)。VM判斷標(biāo)準(zhǔn):管腔內(nèi)存在紅細(xì)胞，周?chē)鷽](méi)有出血壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞襯復(fù)的PAS陽(yáng)性管道、襯復(fù)PAS陽(yáng)性物質(zhì)的腫瘤細(xì)胞圍成不規(guī)則管腔。數(shù)據(jù)以中位數(shù)的形式表示，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)該實(shí)驗(yàn)資料進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象 腫瘤直徑2～10 mm，有淡黑色，表面有豐富的血管，與周?chē)姆悄[瘤組織分界不清，切開(kāi)面呈現(xiàn)紅黑色，呈浸潤(rùn)生長(zhǎng)，實(shí)性、質(zhì)地有彈性和光澤。染色后可見(jiàn)VM、內(nèi)皮依賴(lài)性血管等血液供應(yīng)方式共存現(xiàn)象，部分區(qū)域散在出血壞死。通過(guò)觀察CD31和PAS雙重染色，在該移植瘤的第1周內(nèi)可見(jiàn)到腫瘤間質(zhì)中櫻桃紅色的PAS陽(yáng)性血管樣圖案，VM已形成，1周后逐漸被內(nèi)皮依賴(lài)性血管所替代。

2.2 RCG對(duì)VM時(shí)空變化的影響 通過(guò)觀察VM和內(nèi)皮依賴(lài)性血管的情況，VM密度在腫瘤中央?yún)^(qū)隨時(shí)間變化呈現(xiàn)先增加后遞減趨勢(shì)，并且RCG劑量越大，同一時(shí)刻下的血管生成密度越小。中央?yún)^(qū)的VM較多，周邊區(qū)較少，RCG影響中央?yún)^(qū)比周邊區(qū)要明顯。內(nèi)皮依賴(lài)性血管的密度變化體現(xiàn)了同樣的變化特征。內(nèi)皮依賴(lài)性血管密度在腫瘤中央?yún)^(qū)和外周區(qū)均呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，隨著RCG試劑組濃度的增高，同一時(shí)刻下內(nèi)皮依賴(lài)性血管的密度逐漸降低。

2.3 RCG對(duì)CD31在腫瘤不同區(qū)域的表達(dá)的影響 與生理鹽水組比較，隨著RCG各劑量組濃度的增高，VM中央?yún)^(qū)和外周區(qū)的腫瘤細(xì)胞CD31的表達(dá)逐漸降低，見(jiàn)Tab 1，同樣內(nèi)皮依賴(lài)性血管在腫瘤的中央?yún)^(qū)和外周區(qū)均呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。見(jiàn)Tab 2。因?yàn)榻y(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)均為非正態(tài)分布，故實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均用中位數(shù)表示。

Tab 1 Vasculogenic mimicry CD31 expression in different regions

Tab 2 Endothelium dependent period of CD31 expression in different regions

2.4 相關(guān)性分析 通過(guò)SPSS 19.0分析，在腫瘤數(shù)為20的條件下，不同濃度RCG對(duì)CD31、VM密度的表達(dá)之間存在相關(guān)性，Tab 3可得RCG與CD31、VM密度之間存在密切的負(fù)相關(guān)性。對(duì)其具有一定的抑制作用。

Tab 3 RCG and CD31 correlation analysis，RCG and angiogenesis mimicry density correlation analysis

3 討論

觀察RCG對(duì)黑色素移植瘤的時(shí)空變化的影響及影響其變化的細(xì)胞因子CD31的表達(dá)情況，研究顯示RCG可抑制B16黑色素瘤的血管生成。結(jié)果表明在不同濃度(900、300、100 mg·kg－1)的RCG下，CD31、內(nèi)皮依賴(lài)性血管的濃度和VM的密度呈線(xiàn)性降低(P＜0.05)。并觀察到表達(dá)CD31的腫瘤細(xì)胞在間質(zhì)中彼此黏附，具有連接形成管腔的趨勢(shì)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一部分襯復(fù)在PAS陽(yáng)性物質(zhì)內(nèi)壁的腫瘤細(xì)胞分泌CD31抗原作為一個(gè)細(xì)胞間的連接分子，使腫瘤細(xì)胞在變形后能模仿內(nèi)皮細(xì)胞更好地連接在一起，形成血液通道。國(guó)際上通過(guò)生物試劑研制抗癌新藥的趨勢(shì)正在興起［3］，對(duì)于RCG的研究并不多見(jiàn)，深入研究RCG是必要的［4］。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們，RCG對(duì)于腫瘤的治療可能具有一定的應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)一步研究。

［1］蔣金玲，于穎彥.血管生成擬態(tài)是對(duì)經(jīng)典腫瘤血管生成理論的補(bǔ)充［J］.內(nèi)科理論與實(shí)踐，2010，5(2):183－6.

［1］Jiang J L，Yu Y Y.Vasculogenic mimicry is the generative theory of classical tumor vasculature supplement［J］.J Int Med Concepts Pract，2010，5(2):183－6.

［2］劉曉梅，陳忠平.腫瘤血管生成擬態(tài)和腫瘤干細(xì)胞［J］.中國(guó)神經(jīng)腫瘤雜志，2009，7(4):275－8.

［2］Liu X M，Chen Z P.Vasculogenic mimicry and tumor stem cells［J］.Chin J Neuro-oncol，2009，7(4):275－8.

［3］吳 靜，雷艷麗，金 堅(jiān)，等.rhddADAM15蛋白抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及其機(jī)制［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(9):1218－23.

［3］Wu J，Lei Y L，Jin J，et al.Inhibitory effects and mechanism of rhddADAM15 on the growth of melanoma B16 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(9):1218－23.

［4］Wu S，Yu L，Cheng Z，Song W，et al.Expression of maspin in non-small cell lung cancer and its relationship to vasculogenic mimicry［J］.J Huazhong Univ Sci Technol Med Sci，2012，32(3):346－52.