王月華，侯延娟，任韞卓，韋金英，杜春陽(yáng)，張連珊，史永紅

(河北醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，河北石家莊 050017)

高血糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其造成的系膜細(xì)胞缺失是導(dǎo)致糖尿病腎損傷的主要機(jī)制［1－2］。高血糖引起的活性氧 (reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生對(duì)DN的發(fā)展具有至關(guān)重要的作用［3］。高糖(high glucose，HG)通過(guò)誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞凋亡［1］。研究表明，ROS產(chǎn)生的主要部位是線(xiàn)粒體，在糖尿病血管并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用［4］。SS-31 肽(D-Arg-2’，6’-dimethyltyrosine-Lys-Phe-NH2)屬于小分子可滲入細(xì)胞的肽家族，能夠靶向定位和聚集在線(xiàn)粒體內(nèi)膜［5］。SS-31能夠清除細(xì)胞內(nèi)ROS和抑制線(xiàn)粒體ROS產(chǎn)生，從而防止線(xiàn)粒體通透性改變和細(xì)胞色素C釋放［5］。以往的研究表明，SS-31能夠抑制單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡和腎小管損傷［6］。最近研究顯示，SS-31能抑制高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和線(xiàn)粒體ROS的產(chǎn)生、穩(wěn)定線(xiàn)粒體膜電位、減少細(xì)胞色素C由線(xiàn)粒體向胞質(zhì)釋放和caspase-3表達(dá)［7］。然而，SS-31對(duì) HG誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞的凋亡作用還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討抗氧化肽SS-31對(duì)HG誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡的作用以及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠系膜細(xì)胞(CRL-1927)來(lái)自美國(guó)菌種保藏中心(Manassas，VA)。D-glucose和Mannitol為 Sigma公司產(chǎn)品。兔抗 cleaved caspase-3、p38 MAPK、p-p38 MAPK為美國(guó) Cell Signaling公司產(chǎn)品。小鼠抗 Bax單克隆抗體(P-19)，兔抗 Bcl-2、caspase-3和細(xì)胞色素C多克隆抗體以及ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品。TUNEL試劑盒為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品。SS-31多肽由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成。辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠或兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司。聚偏二氟乙烯膜(PVDF)為美國(guó)Milipore公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組刺激實(shí)驗(yàn) 以含體積分?jǐn)?shù)0.1胎牛血清，2 mmol· L－1L-谷氨酰胺，100 kU·L－1青霉素和 100 mg·L－1鏈霉素的 DMEM-F12(3∶1)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞。待MMCs達(dá)75% ～85%融合后，用無(wú)血清培養(yǎng)基同步24 h。同步后的細(xì)胞分成4組:正常糖組(5.6 mmol·L－1葡萄糖，NG);正常糖+甘露醇組(5.6 mmol· L－1葡萄糖+24.4 mmol·L－1甘露醇，M);高糖組(30 mmol· L－1葡萄糖，HG)，高糖 +SS-31 組(30 mmol· L－1葡萄糖 +100 nmol·L－1SS-31，HG+SS-31)。于刺激 48 h后收集細(xì)胞觀察。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集上清及貼壁細(xì)胞，用PBS洗2次，用體積分?jǐn)?shù)0.70的乙醇4℃固定24 h，PBS洗2次，碘化丙啶避光染色30 min，流式細(xì)胞儀觀察。

1.2.3 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)dUTP缺口標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 MMCs接種于8孔Lab-Tek?腔室玻片(美國(guó)Nalge Nunc公司)上，分組刺激48 h。根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用DeadEndTM熒光TUNEL系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野中陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.2.4 Western印跡檢測(cè) 細(xì)胞用冰冷PBS洗2遍，加入細(xì)胞裂解液(25 mmol·L－1Tris-HCL，10 mmol·L－1EDTA，體積分?jǐn)?shù) 0.01 NP-40，150 mmol·L－1氯化鈉，質(zhì)量濃度 1 g·L－1苯甲基磺酰氟)，冰浴 1 h，4 ℃、14 000 r·min－1離心 25 min，Lowry法測(cè)定上清液蛋白濃度。按照Huang等［8］所述方法分離線(xiàn)粒體和不含線(xiàn)粒體的胞質(zhì)蛋白，本次實(shí)驗(yàn)使用不含線(xiàn)粒體的胞質(zhì)蛋白。細(xì)胞裂解蛋白50 μg，經(jīng)十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜;質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05的脫脂奶粉封閉 PVDF膜 2 h，分別加入 caspase-3、cleaved caspase-3、p38 MAPK、p-p38 MAPK、Bax、Bcl-2以及細(xì)胞色素C抗體，4℃過(guò)夜，洗膜后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠或兔抗體(1∶5 000稀釋)，37℃孵育1.5 h;洗膜后加ECL試劑，然后將PVDF膜放入X線(xiàn)片暗盒，壓片，顯影，定影。用美國(guó)UVP公司LabWorks 4.5分析系統(tǒng)軟件對(duì)Western條帶進(jìn)行定量分析。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 使用熒光探針5-(6)-羧基-2，7-二氯熒光素(CM-DCHFDA，Invitrogen)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量。MMCs接種于6孔板內(nèi)，分組刺激48 h，洗滌細(xì)胞，胰酶消化，懸浮于 PBS，最后加入含 10 μmol·L－1DCHF-DA 的染液中，37℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 SS-31對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡的影響TUNEL和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與NG組相比，在高糖刺激48 h，小鼠系膜細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加(P＜0.01);與HG組相比，SS-31干預(yù)能夠明顯減少高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡數(shù) (P＜0.05，F(xiàn)ig 1，2)。此外，甘露醇對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)影響。

2.2 SS-31對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與NG組相比，HG糖組cleaved caspase-3表達(dá)和 Bax/Bcl-2比率明顯增加(P＜0.01);SS-31干預(yù)能夠明顯抑制HG誘導(dǎo)的cleaved caspase-3表達(dá)和Bax/Bcl-2比率(P＜0.05，F(xiàn)ig 3)。此外，甘露醇對(duì)系膜細(xì)胞cleaved caspase-3表達(dá)和Bax/Bcl-2比率無(wú)影響。

2.3 SS-31對(duì)HG誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C釋放的影響 亞細(xì)胞提取物的Western blot結(jié)果顯示:HG刺激系膜細(xì)胞48 h，與正常糖對(duì)照組相比，高糖組胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C水平明顯增加(P＜0.01);與高糖組相比，SS-31干預(yù)組細(xì)胞胞質(zhì)中細(xì)胞色素C水平明顯降低(P＜0.05，F(xiàn)ig 4)。甘露醇組與正常對(duì)照組相比，胞質(zhì)中細(xì)胞色素C水平無(wú)差異。

Fig 1 Effect of SS-31 on HG-induced apoptosis of MMCs(analyzed by TUNEL，n=6).

Fig 2 Effect of SS-31 on HG-induced apoptosis of MMCs(analyzed by TUNEL，n=6).

Fig 3 Effect of SS-31 on activation of caspase-3 and expression of Bax and Bcl-2 in MMCs(n=6).

Fig 4 Effect of SS-31 on the release of cytochrome C from mitochondria to cytoplasm in MMCs(n=6).

2.4 SS-31對(duì)HG誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:HG刺激系膜細(xì)胞48 h，與正常糖對(duì)照組相比，高糖組系膜細(xì)胞ROS產(chǎn)生明顯升高(P＜0.01);SS-31干預(yù)組細(xì)胞ROS表達(dá)明顯低于高糖組(P＜0.05，F(xiàn)ig 5)。甘露醇組與正常對(duì)照組相比，ROS水平無(wú)差別。

2.5 SS-31對(duì)HG誘導(dǎo)系膜細(xì)胞p38 MAPK激活的影響 在高糖刺激的48 h，與NG組相比，HG組p38 MAPK的磷酸化水平明顯升高(P＜0.01);與高糖組相比，SS-31干預(yù)組p38 MAPK磷酸化水平明顯降低(P＜0.05，F(xiàn)ig 6)。甘露醇組與正常對(duì)照組相比，p38 MAPK磷酸化水平無(wú)差異。

3 討論

既往的研究已證實(shí)，在糖尿病時(shí)，腎臟存在大量ROS的蓄積，破壞了腎臟組織內(nèi)氧化還原動(dòng)態(tài)平衡，造成腎組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)，參與腎損傷的發(fā)生與發(fā)展［9］。多種對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病具有腎臟保護(hù)藥物都具有降低腎臟氧化應(yīng)激狀態(tài)的作用［10－12］。因此，調(diào)節(jié)糖尿病腎臟氧化應(yīng)激狀態(tài)有可能成為有效的治療糖尿病腎病的靶點(diǎn)。

Fig 5 Effect of SS-31 on HG-induced ROS production in MMCs(detected by flow cytometry，n=6).

研究表明，實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病腎小球固有細(xì)胞數(shù)量可通過(guò)細(xì)胞凋亡而減少，并且腎小球系膜細(xì)胞凋亡數(shù)與蛋白尿的程度密切相關(guān)［13］。高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡和系膜缺失是導(dǎo)致糖尿病患者腎臟損傷的一個(gè)主要機(jī)制［1－2］。高糖能夠明顯誘導(dǎo)體外培養(yǎng)系膜細(xì)胞的凋亡，而抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)、二亞苯基碘(DPI)及維生素C能夠明顯抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠系膜細(xì)胞的凋亡［1］。我們的最近的研究也證實(shí)，抗氧化劑tempol以及敲低硫氧還蛋白抑制蛋白(TXNIP)表達(dá)均能夠抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡［14］。本研究結(jié)果顯示，高糖能夠明顯促進(jìn)系膜細(xì)胞ROS產(chǎn)生，同時(shí)伴有細(xì)胞凋亡增加，cleaved caspase-3表達(dá)和Bax/Bcl-2比率升高以及促使細(xì)胞色素C從線(xiàn)粒體釋放入胞質(zhì)。以上提示，高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡和ROS產(chǎn)生密切相關(guān)。

Fig 6 Effect of SS-31 on HG-induced activation of p38 MAPK in MMCs(n=6).

SS-31肽是一種線(xiàn)粒體靶向肽，能夠選擇地集中在線(xiàn)粒體內(nèi)膜并降低線(xiàn)粒體ROS產(chǎn)生［6］。最近的研究證實(shí)SS-31具有明顯的抗氧化和抗凋亡作用。Thomas等［15］的研究表明，SS-31容易滲入胰島細(xì)胞，防止線(xiàn)粒體去極化，減少細(xì)胞凋亡，增加胰島細(xì)胞數(shù)，改善胰島移植后的功能。在大鼠缺血/再灌注腎損傷模型，SS-31能夠加速細(xì)胞ATP恢復(fù)，減少腎小管細(xì)胞凋亡和壞死，減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，并防止腎小管功能障礙［16］。本研究結(jié)果顯示，SS-31干預(yù)能夠抑制HG誘導(dǎo)的MMCs內(nèi)ROS產(chǎn)生，細(xì)胞凋亡，cleaved caspase-3表達(dá)，Bax/Bcl-2比率和細(xì)胞色素C的易位。這些結(jié)果表明，SS-31抑制HG誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)減少ROS和保護(hù)線(xiàn)粒體功能實(shí)現(xiàn)的。

p38蛋白激酶(p38 MAPK)為絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員，是一個(gè)重要的信號(hào)分子，參與調(diào)控包括細(xì)胞凋亡在內(nèi)的許多細(xì)胞功能。Jun等［17］的研究顯示，給予FR 167653(一種p38 MAPK抑制劑)，能夠抑制糖尿病腎小球細(xì)胞和體外HG誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡。我們的研究表明，采用SB203580阻斷p38 MAPK通路能夠明顯抑制HG誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡，cleaved caspase-3 表達(dá)和 Bax/Bcl-2 比率［14］。以上說(shuō)明，p38 MAPK信號(hào)通路可能與系膜細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。有研究表明N-乙酰半胱氨酸能夠抑制順鉑誘導(dǎo)的腎臟細(xì)胞凋亡及p38 MAPK信號(hào)通路的活化，提示N-乙酰半胱氨酸的抗凋亡作用可能與抑制p38 MAPK信號(hào)通路的活化有關(guān)［18］。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，SS-31能夠明顯抑制 HG誘導(dǎo)的 p38 MAPK的活化，提示SS-31抑制HG誘導(dǎo)的MMCs凋亡可能部分是通過(guò)調(diào)節(jié)p38 MAPK通路活化實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，SS-31能夠抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞的凋亡，這種作用可能是通過(guò)減少ROS產(chǎn)生，保護(hù)線(xiàn)粒體功能以及抑制p38MAPK信號(hào)通路的活化實(shí)現(xiàn)的。

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