王 燕，趙美瞇，閔冬雨，胡慧媛，孫雪菲，封 瑞，郝麗英

(1.中國醫(yī)科大學藥學院藥物毒理學教研室，遼寧沈陽 110001;2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中心實驗室，遼寧 沈 陽 116600)

隨著心臟外科體外循環(huán)、冠狀動脈搭橋術(shù)、復(fù)雜先天性心臟病糾治術(shù)、瓣膜置換術(shù)及大血管外科手術(shù)等技術(shù)的推廣應(yīng)用，心肌缺血/再灌注損傷已成為影響心臟血管外科手術(shù)療效的主要難題。心肌缺血/再灌注損傷是指在短時間內(nèi)心肌血供中斷，一定時間內(nèi)恢復(fù)血供后，原缺血心肌發(fā)生較缺血時更為嚴重的損傷［1］。心臟離體研究能夠排除體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)的干擾，是心肌缺血/再灌注研究的重要模型。有研究表明，在含有丙酮酸的條件下，由灌注壓、缺血及缺氧引起的豚鼠離體心臟冠脈流量的改變與其在體情況相似［2］，且豚鼠心臟動作電位、Ca2+流量與人類極為相似［3］，是研究離體心臟的較好動物。然而目前研究所采用的豚鼠缺血/再灌注模型各不相同，缺血時間的選擇上有 30 min［4－5］、40 min［6］、60 min［7］、120 min［8］等，再灌注時間的選擇上有 35 min［9］、60 min［4］和 120 min［10］等。本文通過觀察了3個不同缺血時間對豚鼠離體心臟心功能、心肌組織結(jié)構(gòu)及心肌酶譜的改變，同時觀察了不同再灌注時間LDH等指標的變化，旨在建立確切的豚鼠離體心臟缺血/再灌注損傷模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 豚鼠23只，♀♂不限，280～420 g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)由 Amesco提供，LDH試劑盒、CK試劑盒、MDA試劑盒、SOD試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司，其他試劑均購自國藥集團。

1.1.3 主要配方 Krebs-Henseleit(KH)溶液(mmol· L－1):NaCl 116，KCl 3.6，CaCl21.2，KH2PO41.16，MgSO40.58，NaHCO323.0，Glucose 5.4，Pyruvate 0.3，Insulin 2.8 U·L－1，pH=7.38～ 7.42。0.1 mol·L－1PBS 溶液(mmol·L－1):NaH2PO419，Na2HPO481，NaCl 15.4.

1.1.4 主要儀器設(shè)備 自制 Langendorff裝置、手術(shù)器械1套、pH計(DELTA-320)、動物人工呼吸機(DH-140B)、恒溫水浴鍋(上海凱樂電子設(shè)備廠)、低溫高速離心機(Sigma)、實體顯微鏡(Olympus DF Plapo)、紫外分光光度計(Unic 2800UV/VIS)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備 23只豚鼠飼養(yǎng)觀察1周后，腹腔注射10 mg·kg－1水合氯醛進行麻醉，仰臥位固定，剪開頸部皮膚，分離肌肉，暴露氣管，穿線，剪開氣管，行氣管插管，固定。剪開胸腔，暴露主動脈，分離主動脈旁結(jié)締組織，心臟在體插管，插管成功后將心臟離體并置于37℃的保溫槽中行主動脈逆行灌注(插管后心率小于每分鐘130次者放棄)。溫度控制在(37±0.2)℃，灌注壓為75 cmH2O，并于灌注過程中持續(xù)通入含95%O2和5%CO2混合氣體。

1.2.2 分組 于Langendorff灌流裝置中用KH液灌注心臟，先平衡 10 min，穩(wěn)定 15 min。正常組(Control，n=6)繼續(xù)用KH液灌流90 min;各個缺血/再灌注組均采用止血鉗夾閉灌流管，全心缺血30 min(I30R60，n=6)、40 min(I40R60，n=5)、50 min(I50R60，n=6)，之后松開止血鉗，KH液繼續(xù)灌注60 min。

1.2.3 觀察指標 心率(heart rate，HR):于穩(wěn)定15 min的最后1 min記錄心率作為基礎(chǔ)心率。Control組分別于穩(wěn)定后第 15、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90 min記錄心率;3個缺血/再灌注組均于再灌注第 5、10、15、20、25、30、40、50、60 min 記錄心率，計算各個時間點心率與基礎(chǔ)心率的百分比(%)。

冠脈流量(coronary flow，CF):利用蠕動泵將37℃保溫的灌流液輸送至距離體灌流心臟75 cm高的貯液罐中，并于灌流期始終維持該高度。收集穩(wěn)定15 min的最后1 min灌流液并記錄為基礎(chǔ)冠脈流量。Control組分別于穩(wěn)定 15 min后第 15、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90 min 記錄冠脈流量;3 個缺血/再灌注組均于再灌注第 5、10、15、20、25、30、40、50、60 min記錄冠脈流量。計算各個時間點冠脈流量與基礎(chǔ)冠脈流量的百分比(%)。

灌流液中LDH和CK活力的測定:Control組收集穩(wěn)定15 min的最后1 min、穩(wěn)定15 min后第35、45、55、70、90 min 的灌流液;3 個缺血/再灌注組收集穩(wěn)定 15 min 最后1 min、再灌注第5、15、25、40、60 min的灌流液。－80℃凍存，24 h內(nèi)測定LDH活力。Control組收集穩(wěn)定15 min的最后1 min、穩(wěn)定15 min后第45、90 min的灌流液;3個缺血組收集穩(wěn)定15 min的最后1 min、再灌期第15、60 min灌流液。－80℃凍存，24 h內(nèi)測定CK活力。操作過程按試劑盒說明書進行。

心肌組織MDA和SOD含量測定:取心尖0.1 g左右，于生理鹽水中清洗，加入9倍生理鹽水制備10% 心肌勻漿液，用于測定MDA值;將10% 心肌勻漿液稀釋后測定SOD值。操作過程按試劑盒說明書進行。

心肌梗死面積測定:剩余心肌組織，于－80℃冰箱中凍存15 min，取出，橫切為4片，于0.1 mol·L－1PBS配制的1%TTC溶液中37℃恒溫水浴染色10 min，1周內(nèi)于實體顯微鏡下拍照，Adobe photoshop 3S extended軟件分析梗死面積，并根據(jù):心肌梗死面積/%=未染色面積/心肌片總面積×100%，計算除心耳外剩余3片心臟橫切片的梗死面積(%)。

2 結(jié)果

2.1 不同缺血時間對心率的影響 與Control組相比，3個缺血/再灌注組的心率在再灌期均有一定降低。I30R60組在再灌注第5 min時心率降至基礎(chǔ)心率的70.4% ±8.1%(P＜0.01);其它時間點與Control組相比差異無顯著性。I40R60組再灌期心率變化更為明顯，自再灌注第5 min起差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。I50R60組心率自再灌注第5 min起亦明顯下降(P＜0.01)。

與I40R60組和I50R60組相比，I30R60組再灌注第5、10、15、20、25、3 0、40、50、60 min 的心率是I40R60 組的 1.1、1.2、1.2、1.2、1.2、1.2、1.2、1.2 和1.1倍，兩者于第25 min時差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);I30R60 組再灌注第 5、10、15、20、25、30、40、50、60 min 的心率是I50R60 組的1.1、1.8、1.3、1.3、1.3、1.3、1.3、1.3 和 1.3 倍，兩者于第 10、15、20、25、30、40、50、60 min 差異有統(tǒng)計學意 義 (P＜0.01)，而I40R60組與I50R60組之間差異均無顯著性。見Fig 1。

Fig 1 Changes of heart rate in different ischemic time of myocardial ischemia reperfusion injury in isolated guinea pig hearts

2.2 不同缺血時間對冠脈流量的影響 如Fig 2所示，Control組各時間點的冠脈流量隨著灌注時間的延長而逐漸降低，于第40 min后明顯降低 (P＜0.01)。3個缺血/再灌注組再灌期冠脈流量均有減少。與Control組相比，I30R60組再灌注第25～60 min冠脈流量明顯降低(P＜0.01，P＜0.05)，其它時間點無變化;I40R60組和I50R60組再灌期冠脈流量均明顯降低(P＜0.01，P＜0.05)。

I40R60組與I30R60組相比，冠脈流量僅于再灌注第10、15 min時差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);I30R60 組再灌注第 5、10、15、20、25、30、40、50、60 min的冠脈流量是 I50R60組的1.25、1.38、1.41、1.47、1.44、1.50、1.57、1.66 和1.64 倍，兩者再灌期第10、15、20、25、30、40、50、60 min 冠脈流量之間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);I40R60組與I50R60組之間無差異。

Fig 2 Changes of coronary flow in different ischemic time of myocardial ischemia reperfusion injury in isolated guinea pig hearts

2.3 不同缺血時間對梗死面積的影響 如Fig 3A所示，I40R60和I50R60組心臟TTC染色后白色梗死區(qū)域較I30R60組明顯增加。如Fig 3B所示，I30R60組梗死面積為4.1% ±0.5%，I40R60和I50R60組梗死面積分別增加至15.7%±4.1%和24.3%±2.9%，與Control組(1.4% ±0.5%)相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。I40R60和 I50R60組與I30R60組相比差異有統(tǒng)計學(P＜0.01)，但I40R60組與I50R60組差異之間無統(tǒng)計學意義。

2.4 不同缺血和再灌時間對LDH和CK的影響3個缺血/再灌組再灌注第5 min時LDH漏出量均有升高(Fig 4A)，分別為(138.0±16.20)、(143.8±33.9)、(382.9±90.56)U·L－1，與 Control組(42.85±10.99)U·L－1相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，P＜0.05)。各組LDH漏出量于再灌注第15 min時達到較高值，分別為(171.9±41.89)、(218.4±80.9)、(489.9 ±142.7)U·L－1，與 Control組(36.83±18.39)U·L－1相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。與 Control組相比，I30R60組LDH漏出量于再灌注25、40、60 min差異無統(tǒng)計學意義;I40R60組于再灌注第40 min差異有顯著性，再灌注第25、60 min時差異無統(tǒng)計學意義;I50R60組于再灌注第25、40、60 min 3個時間點的LDH漏出量明顯增加(P＜0.01)。I30R60組與I40R60組各灌注時間點的LDH漏出量之間差異均無統(tǒng)計學意義，I40R60組與I50R60組差異亦無顯著性。但I30R60組與I50R60組相比，除穩(wěn)定期和再灌注第40 min點外，其余時間點之間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。

Fig 3A Photos of TTC Fig 3B Changes of infarct size in different ischemic time of myocardial ischemia reperfusion injury in isolated guinea pig hearts(n=5)

I30R60、I40R60、I50R60組再灌期CK漏出量均增加，且隨缺血時間延長而增多，各組再灌注第15 min時CK漏出量依次為(92.85±39.08)、(439.9±260.5)、(837.5 ±173.9)U·L－1，再灌注第 60 min時CK漏出量依次為(202.8±72.5)、(223.15±157.6)、(620.5 ±143.0)U·L－1。與 Control組相比，I30R60組第 15 min、I50R60組第 15、60 min CK漏出量差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。I30R60組與I40R60組所測3個時間點的CK漏出量之間差異均無統(tǒng)計學意義，I40R60組與I50R60組差異亦無顯著性。但I50R60組第15、60 min CK漏出量與I30R60組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，F(xiàn)ig 4B。

Fig 4A Changes of LDH in different ischemic time of myocardial ischemia reperfusion injury in isolated guinea pig heartsFig 4B Changes of CK in different ischemic times of myocardial ischemia reperfusion injury in isolated guinea pig hearts

2.5 不同缺血時間對SOD和MDA的影響 Fig 5A所示，與Control組相比，3個缺血/再灌注組心肌組織中的SOD值隨缺血時間的延長而降低。I30R60和I40R60組SOD值分別為(12 5853±9 094)、(106 392 ±3 844)U·g－1Pro與 Control組(140 446±1 5612)U·g－1Prot相比差異無統(tǒng)計學意義。I50R60組SOD值為(99.3±6.5)U·g－1Pro，與Control組和I30R60組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，與 I40R60組相比差異無統(tǒng)計學意義。

與Control組相比，3個缺血/再灌注組心肌組織中MDA值均降低，其中 I30R60組 MDA值為(3.2±0.8)μmol·g－1Pro與 Control組(3.3±0.5)μmol·g－1Pro相比差異無統(tǒng)計學意義。I40R60組和I50R60組 MDA值分別為(1.4±0.1)、(1.9±1.0)μmol·g－1Pro，與 Control組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)，但與I30R60組相比差異無統(tǒng)計學意義。I40R60與I50R60組之間差異無顯著性(Fig 5B)。

Fig 5A Changes of SOD in different ischemic time of myocardial ischemia reperfusion injury in isolated guinea pig heartsFig 5B Changes of MDA in different ischemic time of myocardial ischemia reperfusion injury in isolated guinea pig heart(n=5)

3 討論

本研究主要采用呼吸機支持下心臟離體手術(shù)及Langendorf灌流裝置，實驗條件均嚴格參照 Liao等［11］及 Skrzypiec-Spring 等［12］文獻。在本實驗中，Langendorff裝置高度、潔凈度、灌流液及實驗溫度至關(guān)重要。實驗中需使用蠕動泵實時控制液面高度，以保證心率和冠脈流量測定的準確性。實驗前后均應(yīng)采用高溫蒸餾水沖洗Langendorff裝置，消除細菌對心臟的影響。配制KH液應(yīng)用去離子水且KH液的pH值應(yīng)嚴格控制于7.38～7.42。灌流過程中KH液溫度及保溫槽中溫度均保持(37±0.2)℃。

本實驗結(jié)果表明，豚鼠離體心臟缺血后再灌注能引起心率下降、冠脈流量減少及心肌組織梗死。對于上述指標，隨著缺血時間的延長變化漸為明顯，提示損傷程度可能與缺血時間密切相關(guān)。

乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)是心肌細胞胞質(zhì)中存在的兩類酶，當細胞膜通透性增加時這些物質(zhì)能透過胞質(zhì)釋放到冠狀動脈中。本研究發(fā)現(xiàn)，心臟缺血后灌流液中LDH漏出量隨再灌注時間的延長而增多，3個不同缺血時間的缺血/再灌注組中LDH和CK漏出量均于再灌注第15 min時達到較高值，說明此時心臟缺血/再灌注損傷引起的細胞膜損傷程度較為嚴重。這與Ferrera等［13］的報道稍有不同，該報道證實LDH漏出量在大鼠再灌期第60 min時達到最大值，差異存在的原因可能與實驗所選用的動物及KH液成分不同有關(guān)，尤其與本實驗所用的丙酮酸更為密切。丙酮酸是參于整個生物體基本代謝的中間產(chǎn)物之一，可通過乙酰CoA和三羧酸循環(huán)實現(xiàn)體內(nèi)糖、脂肪和氨基酸間的互相轉(zhuǎn)化，因此，丙酮酸在三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝聯(lián)系中起著重要的樞紐作用。Bunger等［2］發(fā)現(xiàn)，在KH液中添加2.0 mmol·L－1丙酮酸能夠使豚鼠離體心臟的心功能、冠脈流量等相對穩(wěn)定并持續(xù)至90 min以上，因而能將心臟灌流過程中由于各種不穩(wěn)定因素引起的損傷降低，使Control組LDH和CK值相對穩(wěn)定。這也可能正是本實驗觀察到LDH和CK值漏出量于心臟再灌注第15 min時達到較大的主要原因。

關(guān)于缺血/再灌注損傷機制目前主要有自由基學說、鈣超載學說等，其中對缺血/再灌注損傷中自由基的研究是國內(nèi)外學者甚為關(guān)注的問題。本實驗通過測定3個不同缺血/再灌注組組織中SOD及MDA值后發(fā)現(xiàn)，隨缺血時間的延長，組織中的SOD值有所降低，與眾多報道文獻相同。對于MDA值，文獻報道結(jié)果并不一致，包括增加［14－15］和不變［16］。本研究結(jié)果顯示MDA值有所下降，考慮可能與豚鼠離體心臟損傷后MDA透過細胞膜滲入灌流液后而導致組織中含量過低相關(guān)［17］。

本研究表明，豚鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的程度明顯受缺血時間長短的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，I30R60組在再灌期的心率和冠脈流量指標上有所下降，梗死面積、灌流液中LDH、CK量均高于前者，但心率變化中除15 min外其它均無明顯變化，冠脈流量自第25 min起有明顯變化，LDH漏出量只在第5及15 min時有明顯升高，CK漏出量也只于第5 min時有明顯增加，說明缺血30 min對豚鼠離體心臟所造成的再灌注損傷較為柔和，許多指標所顯示的缺血/再灌注損傷不夠明確。I40R60組再灌期心率和冠脈流量各時間點均有明顯變化，梗死面積更有明顯增加，但LDH和CK漏出量與I30R60組相似，并非在所有再灌注時間點均有明顯升高。然而上述所有觀察指標，在I50R60組中差異均有顯著性。因而認為豚鼠離體心臟缺血/再灌注損傷模型的建立以缺血50 min為宜。根據(jù)不同再灌時間LDH和CK值的變化，再灌時間可考慮限制于15～60 min。

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