齊元麟，張明芳，胡建石，徐劍文，林建銀

(福建醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究中心，消化道惡性腫瘤教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.生理學(xué)與病理生理學(xué)系，3.人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系，福建 福州 350004)

整合素(integrin)是細(xì)胞膜上一類重要的跨膜糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞間及細(xì)胞-基質(zhì)間的黏附，控制細(xì)胞的增殖、凋亡和分化，而影響胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合及腫瘤生成和轉(zhuǎn)移等過(guò)程［1-2］。去整合素(disintegrin)是蛇毒中一類含有RGD模體的多肽，能阻斷整合素與配體的結(jié)合，具有抑制血小板聚集、抑制骨吸收及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移與血管新生等生物學(xué)功能［3-5］，其藥物開發(fā)潛力引起關(guān)注［6-8］。

本研究選擇來(lái)自竹葉青(Trimeresurus stejnegeri)的trigramin(竹葉青素)作為研究對(duì)象，合成竹葉青素基因并在大腸桿菌中表達(dá)、純化和鑒定，同時(shí)從竹葉青蛇毒中分離純化天然竹葉青素作為對(duì)照，為研究蛇毒去整合素生物學(xué)活性和可能的開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人膀胱癌細(xì)胞株ECV304由本實(shí)驗(yàn)室保種，培養(yǎng)條件為:含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃和5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 竹葉青蛇毒，淡黃色凍干粉，產(chǎn)地:江西;胎牛血清，杭州四季青公司;DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素，Invitrogen公司;BL21工程菌、pET-42a載體、BugBuster HT、rLysozyme、還原型谷胱甘肽，羅氏公司;Spe I、Xho I限制性內(nèi)切酶，New England Biolabs公司;CCK-8試劑盒，同仁化學(xué)研究所;GSTrap FF親和層析柱、Sephacryl S-300分子篩層析柱，GE Healthcare公司;Lichrospher C18層析柱，Merck公司。其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 竹葉青素全基因合成 將竹葉青素Trigramin序列(NCBI accession number:X51530.1)分為相互重疊的4個(gè)片段，分別合成相應(yīng)寡核苷酸A、B、C、D，并設(shè)計(jì)相應(yīng)引物 ABF、ABR、CDF、CDR。取 A、B、ABF、ABR 各10 pmol加入1×PCR Buffer中，100℃變性2 min，在2.5 h內(nèi)緩慢退火至37℃，然后加入Taq酶，常規(guī)PCR擴(kuò)增拼接AB片段。如法拼接CD后，利用合成的AB和CD片段進(jìn)一步拼接完成全序列。產(chǎn)物進(jìn)一步克隆入pUC19載體，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。引物序列見Tab 1。

Tab 1 List of primers for gene synthesis

1.4 竹葉青素的原核表達(dá) 將Trigramin從pUC19載體亞克隆到pET-42a表達(dá)載體的Spe I和Xho I位點(diǎn)，抽提質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化工程菌BL21，篩選單克隆接種至搖瓶，以2.5 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。Phoretid 1D軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 重組竹葉青素的純化 重組竹葉青素轉(zhuǎn)化菌和空質(zhì)粒pET-42a轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h后，離心收集細(xì)菌沉淀并稱重，加入BugBuster HT裂解細(xì)菌(每克菌體加入5 ml試劑)，同時(shí)加入溶菌酶(rLysozyme)至終濃度1 kU/ml，溫和裂解，去除沉淀，上清液上樣于GSTrap FF親和層析柱，以Tris緩沖液(50 mmol·L-1Tris，10 mmol·L-1還原型谷胱甘肽)洗脫目的蛋白。

1.6 天然蛇毒中竹葉青素的分離純化 竹葉青粗毒0.5 g溶于5 ml 0.05 mol·L-1的Tris緩沖液(pH 8.0)，16 000×g離心15 min，棄去不溶的沉淀，取上清液上樣于Sephacryl S-300預(yù)裝柱(2.6 cm×60 cm)，在AKTA prime純化系統(tǒng)上進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析。將分子篩分離得到的具有抑制血小板聚集活性的組分上樣于Lichrospher C18 4.6/250反相色譜柱，經(jīng)兩次反相高效液相色譜分離，得到純化的竹葉青素。SDS-PAGE鑒定蛋白均一性。

1.7 血小板聚集實(shí)驗(yàn) 人的靜脈血樣采自健康志愿者的肘前靜脈，離心法制備富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)。用PPP稀釋PRP使血小板終濃度為3×108·L-1。在200 μl PRP中分別加入不同濃度的天然或重組竹葉青素，在MPG-3E血液凝聚儀中測(cè)定血小板聚集率。計(jì)算抑制率的公式如下:

繪制劑量-效應(yīng)曲線，求得半數(shù)抑制濃度(IC50)，IC50定義為聚集受抑制達(dá)到最大值的一半時(shí)的竹葉青素的終濃度。

1.8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液(1×108·L-1)，接種至96孔板，每孔100 μl，每組細(xì)胞設(shè)5個(gè)復(fù)孔。37℃和5%CO2實(shí)驗(yàn)條件下常規(guī)培養(yǎng)。對(duì)照組為完全培養(yǎng)基，Trigramin組、GST-Control組和GST-Trigramin分別為含10 mg·L-1天然竹葉青素、100 mg·L-1GST對(duì)照蛋白和100 mg·L-1重組竹葉青素的完全培養(yǎng)基，d 1、2、3、4、5分別取出一塊板檢測(cè)，每孔加入 CCK-8 10 μl，37℃培養(yǎng)1 h后，酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm處的光吸收度，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.9 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 用250 μl/well的Fibronectin(10 mg·L-1)包被24孔培養(yǎng)板，37℃孵育2 h，超凈臺(tái)風(fēng)干1 h，每孔加入250 μl含0.1%BSA的無(wú)血清培養(yǎng)液，37℃孵育1 h。將常規(guī)傳代的細(xì)胞消化洗滌后，以每孔2×105個(gè)的密度接種入包被好的24孔板，細(xì)胞融合后換成無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞同步化。用移液器吸頭沿培養(yǎng)板底部呈“一”字型劃痕，鏡下記錄劃痕區(qū)相對(duì)距離，PBS輕輕洗滌兩次以去除細(xì)胞碎片，無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌后，更換含2%血清的培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)組分別為含2%血清的10 mg·L-1天然竹葉青素、100 mg·L-1GST對(duì)照蛋白和100 mg·L-1重組竹葉青素)，培養(yǎng)24 h，觀察劃痕區(qū)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2)暴雨過(guò)程MCS的發(fā)展有多種組織方式,東西向雨帶不斷的后部建立型和隨后對(duì)流單體的列車效應(yīng)是6月26日夜間到凌晨MCS發(fā)展的主要方式。27日凌晨到早晨,對(duì)流元向東北—西南向發(fā)展形成多個(gè)近乎平行的東北—西南向雨帶,有2種尺度的對(duì)流組織方式:一種是新生對(duì)流單體沿著每個(gè)雨帶向東北方向移動(dòng)的列車效應(yīng),另一種是雨帶沿著線狀MCS向東平流的“列車帶效應(yīng)”。27日白天,梅雨鋒鋒面雨帶中東北—西南向短雨帶的不斷東移是降水持續(xù)的原因。

Fig 1 Gene synthesis and E.coli expression of snake venom disintegrin Trigramin

2 結(jié)果

2.1 竹葉青素基因合成及原核表達(dá) 采用緩慢退火-PCR方法，將片段引物拼接成完整的竹葉青素基因，并克隆入pUC19載體，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤。將基因亞克隆至原核表達(dá)載體pET-42a，在BL21菌株中用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化組表達(dá)出GST對(duì)照蛋白(38.5 ku)，重組竹葉青素轉(zhuǎn)化組表達(dá)出融合蛋白GST-Trigramin(35.9 ku)，而未誘導(dǎo)組在相應(yīng)位置無(wú)表達(dá)，蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白比例分別為31.5%(GST對(duì)照)與40.7%(Trigramin)，見 Fig 1。

2.2 重組竹葉青素的純化和鑒定 BugBuster抽提到的菌體可溶蛋白經(jīng)親和層析純化后，對(duì)照蛋白在38 ku、重組蛋白在36 ku附近呈現(xiàn)出一條蛋白主帶，與GST對(duì)照蛋白及GST-Trigramin融合蛋白的大小一致，純度分別為83.2%和89.1%。見Fig 2。

2.3 天然竹葉青素的純化和鑒定 竹葉青蛇毒經(jīng)Sephacryl S-300分為5個(gè)峰，其中Ⅳ峰和Ⅴ峰具有抑制血小板聚集能力，收集Ⅳ峰，經(jīng)兩次反相HPLC分離，得到單一峰。經(jīng)SDS-PAGE鑒定為均一組分，分子質(zhì)量為8.5 ku。見Fig 3。

Fig 2 Purification of GST-Trigramin by GST-bind affinity chromatography

2.4 竹葉青素對(duì)血小板聚集的影響 天然和重組竹葉青素均可抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，且呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，而GST對(duì)照蛋白不能抑制血小板聚集。天然竹葉青素半數(shù)抑制濃度(IC50)為3.0 mg·L-1(0.35 μmol·L-1)，重組竹葉青素的IC50為 28.2 mg·L-1(0.78 μmol·L-1)。見 Fig 4。

2.5 竹葉青素對(duì)細(xì)胞增殖的影響 10 mg·L-1天然竹葉青素、100 mg·L-1GST對(duì)照蛋白和100 mg·L-1重組竹葉青素均不影響ECV304細(xì)胞增殖，各組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)差異無(wú)顯著性，見Fig 5。

2.6 竹葉青素對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響 10 mg·L-1天然竹葉青素和100 mg·L-1重組竹葉青素可抑制劃痕的愈合，而100 mg·L-1GST對(duì)照蛋白不能抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，說(shuō)明重組竹葉青素抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的功能來(lái)自其去整合素結(jié)構(gòu)域。見Fig 6。

Fig 3 Purification of native trigramin from crude venom of Trimeresurus stejnegeri

3 討論

去整合素在蛇毒中含量甚微，克隆其基因并在各種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組蛋白，是研究其生物學(xué)功能并進(jìn)一步開發(fā)利用的有效手段。本研究首先合成竹葉青素基因，以GST融合蛋白形式在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中獲得高效表達(dá)，重組蛋白產(chǎn)量占菌體總蛋白量的37.6%;隨后采用親和層析技術(shù)純化重組融合蛋白，得到了純度為89.1%的重組 GST-Trigramin，為研究其功能奠定了基礎(chǔ)。GST是原核表達(dá)中常用標(biāo)簽，它在菌體內(nèi)高度可溶并能協(xié)助融合蛋白的折疊，有助于獲取有活性的重組蛋白。Seoane［9］和 Teklemariam［10］分別用 GST 融合蛋白形式在原核體系表達(dá)了小盾響尾蛇(Crotalus scutulatus scutulatus)去整合素mojastin和銅頭蝮(Agkistrodon contortrix contortrix)去整合素樣肽 acocostatin，并探討了它們誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的功能，發(fā)現(xiàn)GST融合去整合素在原核表達(dá)體系中能夠正確折疊并具有生物學(xué)活性。

Fig 4 In vitro inhibition of ADP-induced aggregation of normal human PRP by native and recombinant trigramins

Fig 5 Effects of native and recombinant trigramins on ECV304 cell proliferation

Fig 6 Effects of native and recombinant trigramins on in vitro cell motility

本研究顯示，重組GST-Trigramin能抑制血小板聚集和細(xì)胞遷移，其抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的IC50為 0.78 μmol·L-1，而從蛇毒中純化得到的竹葉青素抑制血小板聚集的IC50為0.35 μmol·L-1，說(shuō)明重組GST-Trigramin能夠折疊成活性結(jié)構(gòu)，但其活性與天然純化的蛋白有一定差別，其原因可能為①重組竹葉青素不能100%折疊為天然結(jié)構(gòu)，②GST結(jié)構(gòu)域干擾了竹葉青素與底物的結(jié)合，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本研究進(jìn)一步探討竹葉青素對(duì)人膀胱癌細(xì)胞ECV304增殖和運(yùn)動(dòng)的影響，發(fā)現(xiàn)天然和重組竹葉青素均不影響腫瘤細(xì)胞增殖，但可抑制腫瘤細(xì)胞的體外運(yùn)動(dòng)能力。Ramos［11］發(fā)現(xiàn)特異性抑制αvβ3的去整合素DisBa-01，可抑制黑素瘤轉(zhuǎn)移和bFGF介導(dǎo)的血管新生，Tian等［12］發(fā)現(xiàn)去整合素eristostatin可抑制纖粘連蛋白與細(xì)胞的結(jié)合，而抑制腫瘤細(xì)胞的活動(dòng)能力，竹葉青素抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)可能也通過(guò)類似的機(jī)制。

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