張 旋，楊柳萌，鄭永唐

(1.中國科學(xué)院昆明動物研究所中國科學(xué)院和云南省動物模型與人類疾病機理重點實驗室，云南昆明 650223;2.昆明醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南昆明 650031;3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100039)

目前，美國FDA已批準(zhǔn)30多種抗HIV藥物用于臨床，可組成20多種高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)。盡管HAART療法明顯降低了AIDS/HIV患者的死亡率，但依然存在耐藥、服藥繁瑣、依從性差、費用高、無法徹底清除病毒和毒副作用等問題［1－2］。因此，尋找具有新作用靶點的新一代抗HIV藥物非常必要。

整合酶(Integrase，IN)是HIV-1復(fù)制所必需的酶，而且宿主細(xì)胞內(nèi)不存在該酶類似物，因此，已成為抗HIV-1藥物的理想靶點［3－4］。近年來，關(guān)于整合酶抑制劑的研究報道層出不窮，但迄今為止，Raltegravir仍是唯一上市的HIV整合酶抑制劑。因而，發(fā)現(xiàn)新一代整合酶抑制劑具有重要意義。高通量、高靈敏、簡單易行的篩選方法是發(fā)現(xiàn)新一代整合酶抑制劑的前提。目前報道的整合酶抑制劑篩選方法已經(jīng)有多種，各有優(yōu)缺點，該文將對文獻(xiàn)報道的這些方法及最新進展做一介紹。

1 HIV-1整合酶結(jié)構(gòu)與功能

整合酶是由HIV-1 pol基因編碼的蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量32 ku，由288個氨基酸殘基構(gòu)成，可分為3個功能結(jié)構(gòu)域:N端結(jié)構(gòu)域(NTD:1～50)、催化核心結(jié)構(gòu)域(CCD:51～212)和C端結(jié)構(gòu)域(CTD:213～288)。CCD包含酶的活性中心，具有催化活性［5］。2010年，整合酶的三維晶體結(jié)構(gòu)被成功解析［6］，有助于研發(fā)出更高效、特異和低毒的新一代整合酶抑制劑。在HIV-1復(fù)制過程中，整合酶的功能是將病毒DNA整合到宿主細(xì)胞染色體中，這一過程主要由整合酶的3'端加工和鏈轉(zhuǎn)移活性來完成［5］。在體外，二聚體形式的整合酶就具有3'端加工活性，而只有四聚體形式的整合酶才具備鏈轉(zhuǎn)移活性［7］。

2 設(shè)計整合酶抑制劑的作用靶點

根據(jù)整合酶的結(jié)構(gòu)與功能，應(yīng)從以下靶點來設(shè)計整合酶抑制劑:① 抑制3'端加工活性;② 抑制鏈轉(zhuǎn)移活性;③ 抑制IN核定位;④抑制IN多聚體形成;⑤ 抑制IN與DNA的結(jié)合;⑥抑制IN與宿主細(xì)胞因子結(jié)合。

Fig 1 Principle of TRFIA for HIV-1 integrase 3'-processing activity［13］

3 HIV-1整合酶抑制劑篩選方法

3.1 酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是以微孔板為基礎(chǔ)的一種高通量篩選方法，近年來被廣泛用于HIV-1整合酶抑制劑篩選。此法通常采用磷酸化DNA底物或親和素－生物素體系標(biāo)記的DNA底物包被微孔板，應(yīng)用酶(HRP或AKP)標(biāo)記的二抗，加入酶底物或化學(xué)發(fā)光底物來檢測反應(yīng)產(chǎn)物［8－10］。ELISA方法的優(yōu)點是操作簡單、快速、無放射性污染和高通量，缺點是微孔板需要特殊預(yù)處理，DNA底物需要標(biāo)記，封閉易造成非特異性吸附和背景信號干擾，只能檢測整合酶總活性或者鏈轉(zhuǎn)移活性，不能單獨檢測3'端加工活性。何紅秋等［11］采用的熒光方法檢測整合酶鏈轉(zhuǎn)移活性是一種改良的ELISA方法，其改良之處在于采用了熒光素FITC標(biāo)記的二抗，直接用熒光酶標(biāo)儀來檢測，提高了檢測靈敏度。何紅秋等［12］還對ELISA方法進行了另一種改良，采用鏈親和素標(biāo)記的磁珠來捕獲生物素標(biāo)記的整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)物，該法節(jié)省了對微孔板包被的步驟，節(jié)省了時間，提高了檢測特異性。

3.2 時間分辨熒光法 時間分辨熒光法(time resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是一種以稀土元素(多用Eu)為標(biāo)記、用時間分辨技術(shù)測量熒光的非同位素免疫分析技術(shù)。TRFIA檢測整合酶3'端加工抑制劑的原理是，合成一段HIV-1 LTR的U5端DNA序列，在其3'端標(biāo)記生物素，然后將其包被在微孔板中，加入待測化合物孵育，再加入整合酶進行3'端加工反應(yīng)后，通過洗滌去除剪切的生物素標(biāo)記的核苷酸，然后加入親和素偶聯(lián)的Eu(SA-Eu)，SA-Eu可結(jié)合未剪切的生物素標(biāo)記的底物序列，通過時間分辨熒光計檢測熒光信號(Fig 1)［13－15］。從某種程度上講，TRFIA即是一種改良的ELISA方法，也是一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法。TRFIA同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，與傳統(tǒng)ELISA比較，大大提高靈敏度和穩(wěn)定性，不足之處是成本相對較高。

3.3 AlphaScreen AlphaScreen，也稱為納米均相時間分辨熒光免疫分析技術(shù)，其利用作為供體和受體的水凝膠微珠來檢測生物分子的相互作用。AlphaScreen目前已被用于篩選整合酶二聚體抑制劑、整合酶與宿主細(xì)胞因子(Importin和LEDGF/p75)相互作用抑制劑［16－20］。以整合酶二聚體抑制劑篩選為例，將GST-IN和His-IN單聚體和Ni2+-受體微珠(用來結(jié)合His-IN)、待測化合物和glutathione-供體微珠(用來結(jié)合GST-IN)一起孵育，在680 nm激光照射下，供體微珠上的光敏劑受激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧，當(dāng)GST-IN和His-IN形成二聚體時，單線態(tài)氧擴散至受體微珠，進一步激活了同樣在受體微珠上的熒光基團，使之發(fā)出熒光，波長為520～620 nm，當(dāng)化合物有抑制作用時，GST-IN和His-IN不能形成二聚體，單線態(tài)氧無法擴散至受體，不會有熒光信號產(chǎn)生(Fig 2)。AlphaScreen的優(yōu)點是高通量、無需包被和洗板、耗時短、靈敏度高，不足之處是成本相對較高。

Fig 2 Principle of HIV-1 integrase dimerization AlphaScreen assay［16］

3.4 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)是近年來應(yīng)用的一種新的HIV-1整合酶抑制劑篩選方法［15，21］。該方法是將2個熒光基團分別偶聯(lián)在DNA兩端(3'端加工:偶聯(lián)在供體DNA兩端;鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng):分別偶聯(lián)在供體DNA和靶DNA末端)，當(dāng)2個熒光基團距離合適時，熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移，如受體熒光量子產(chǎn)率為零，則發(fā)生熒光猝滅;如受體也是一種熒光發(fā)射體，則呈現(xiàn)出受體熒光。有研究采用的分子信標(biāo)方法檢測整合酶3'端加工反應(yīng)的原理實質(zhì)上也是熒光共振能量轉(zhuǎn)移［11－22］。FRET為液相反應(yīng)，能夠更好的模擬體內(nèi)反應(yīng)環(huán)境，能分別檢測各步反應(yīng);不需要包被和封閉微孔板，減少了一些耗時耗力的操作;使用熒光檢測系統(tǒng)，靈敏度較高，而且可以高通量篩選。此方法的不足在于需要熒光酶標(biāo)儀，不易普及。

3.5 細(xì)胞水平整合酶抑制劑篩選方法 2011年，Van等［23］設(shè)計出一種細(xì)胞水平高通量整合酶抑制劑篩選方法。該方法利用有熒光素酶報告基因的假病毒感染MT-4細(xì)胞，隨后用RT抑制劑奈韋拉平使假病毒復(fù)制同步后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4.5 h，使逆轉(zhuǎn)錄完成，然后將細(xì)胞和待測化合物加入微孔板，孵育過夜(±20 h)，感染細(xì)胞可表達(dá)熒光素酶，加入熒光素酶底物，熒光酶標(biāo)儀進行檢測。該方法優(yōu)點是高通量、高靈敏度、無需合成供體和靶DNA，缺點是不能直接檢測化合物對整合酶活性的影響，而只是檢測化合物作用在整合階段。細(xì)胞水平假病毒模型篩選也可通過MAGI檢測法來實現(xiàn)，即采用可誘導(dǎo)表達(dá)MAGI的TZM-b1細(xì)胞或MAGI-5細(xì)胞，在感染HIV后，細(xì)胞內(nèi)整合的HIV LTR β-gal報告基因表達(dá)，感染細(xì)胞染成藍(lán)色，在顯微鏡下計數(shù)藍(lán)色細(xì)胞數(shù)即可判斷HIV感染情況［24－25］。該方法比較經(jīng)濟，但無法實現(xiàn)高通量，而且人工計數(shù)存在主觀性。細(xì)胞水平篩選還可應(yīng)用野生型HIV-1，根據(jù)HIV在細(xì)胞中的復(fù)制周期，采用分時加藥的方法進行，并選擇相應(yīng)的進入抑制劑、RT抑制劑和整合酶抑制劑作為陽性對照藥，通過顯微鏡下觀察細(xì)胞病變或ELISA檢測p24，可以大致判斷待測藥物是否作用在整合階段［26－27］。該方法費時費力，無法精確判定藥物是否直接抑制整合酶活性。

整合酶必需進入細(xì)胞核才能完成整合功能，因此抑制整合酶的細(xì)胞核定位可有效抑制HIV-1在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制［28－29］。整合酶核定位抑制劑的篩選也是基于細(xì)胞水平的熒光顯微鏡方法［28，30－31］。原理是將熒光蛋白與整合酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞或HeLa細(xì)胞，然后加入待測化合物，熒光顯微鏡下觀察整合酶在細(xì)胞內(nèi)分布情況。如果化合物有抑制作用，則熒光信號主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。該方法的優(yōu)點是可以高通量，缺點是檢測結(jié)果僅僅是定性判斷。

3.6 其他方法 除上述方法外，整合酶抑制劑篩選尚有放射自顯影法［32］、實時熒光定量 PCR 方法［33－35］、表面等離子共振(SPR)［36］等方法。放射自顯影法應(yīng)用最早，但需要進行凝膠電泳，耗時耗力，無法高通量，且放射性元素污染環(huán)境，故現(xiàn)已少用。實時熒光定量PCR方法雖然精確度和靈敏度高，但無法實現(xiàn)高通量，且成本較高。SPR雖然可以高通量篩選，但成本較高、需要特殊Biacore檢測儀器，故也不能普及。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，整合酶抑制劑也可借助借助計算機技術(shù)和專業(yè)軟件進行虛擬篩選，主要針對整合酶的三維結(jié)構(gòu)或已知抑制劑的藥效團，從化合物數(shù)據(jù)庫篩選整合酶抑制劑［37－40］。與傳統(tǒng)實驗篩選相比，虛擬篩選優(yōu)勢在于高效、快速、經(jīng)濟，但缺乏完善有效的評估體系，未考慮藥物復(fù)雜的作用機制及體內(nèi)毒性等問題。將實驗篩選方法和虛擬篩選結(jié)合是今后藥物篩選的方向，有望研發(fā)出新一代強效、特異的HIV整合酶抑制劑。

［1］Cane P A.New developments in HIV drug resistance［J］.J Anti-microb Chemother，2009，64(Suppl 1):i37－40.

［2］Johnson M O，Charlebois E，Morin S F，et al.Perceived adverse effects of antiretroviral therapy［J］.J Pain Symptom Manage，2005，29(2):193－205.

［3］Lutzke R A，Plasterk R H.HIV integrase:a target for drug discovery［J］.Genes Funct，1997，1(5－6):289－307.

［4］Nair V.HIV integrase as a target for antiviral chemotherapy［J］.Rev Med Virol，2002，12(3):179－93.

［5］Chiu T K，Davies D R.Structure and function of HIV-1 integrase［J］.Curr Top Med Chem，2004，4(9):965－77.

［6］Hare S，Gupta S S，Valkov E，et al.Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer［J］.Nature，2010，464(7286):232－6.

［7］Li M，Mizuuchi M，Burke T R Jr，Craigie R.Retroviral DNA integration:reaction pathway and critical intermediates［J］.EMBO J，2006，25(6):1295－304.

［8］馮微宏，黃建松，詹金彪.ELISA法分析HIV-1整合酶的生物學(xué)活性［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2007，36(2):179－84.

［8］Feng W H，Huang J S，Zhan J B.Analysis on bioactivity of HIV-1 integrase by ELISA method［J］.J Zhejiang Univ(Med Sci)，2007，36(2):179－84.

［9］John S，F(xiàn)letcher T M 3rd，Jonsson C B.Development and application of a high-throughput screening assay for HIV-1 integrase enzyme activities［J］.J Biomol Screen，2005，10(6):606－14.

［10］Chang Y C，Ching T T，Syu W J.Assaying the activity of HIV-1 integrase with DNA-coated plates［J］.J Virol Methods，1996，59(1－2):135－40.

［11］何紅秋，程紹輝，劉 斌，等.用熒光方法檢測HIV-1整合酶的體外活性［J］.光散射學(xué)報，2009，21(2):185－9.

［11］He H Q，Cheng S H，Liu B，et al.Detection of HIV-1 integrasein vitroactivities using fluorescent technology［J］.J Light Scatt，21(2):185－9.

［12］He H Q，Ma X H，Liu B，et al.A novel high-throughput format assay for HIV-1 integrase strand transfer reaction using magnetic beads［J］.Acta Pharmacol Sin，2008，29(3):397－404.

［13］Han Y S，Quashie P，Mesplede T，et al.A high-throughput assay for HIV-1 integrase 3'-processing activity using time-resolved fluorescence［J］.J Virol Methods，2012，184(1－2):34－40.

［14］Tsiang M，Jones G S，Hung M，et al.Dithiothreitol causes HIV-1 integrase dimer dissociation while agents interacting with the integrase dimer interface promote dimer formation［J］.Biochemistry，2011，50(10):1567－81.

［15］Wang Y，Klock H，Yin H，et al.Homogeneous high-throughput screening assays for HIV-1 integrase 3beta-processing and strand transfer activities［J］.J Biomol Screen，2005，10(5):456－62.

［16］Demeulemeester J，Tintori C，Botta M，et al.Development of an AlphaScreen-based HIV-1 integrase dimerization assay for discovery of novel allosteric inhibitors［J］.J Biomol Screen，2012，17(5):618－28.

［17］Tintori C，Demeulemeester J，F(xiàn)ranchi L，et al.Discovery of small molecule HIV-1 integrase dimerization inhibitors［J］.Bioorg Med Chem Lett，2012，22(9):3109－14.

［18］Hou Y，McGuinness D E，Prongay A J，et al.Screening for antiviral inhibitors of the HIV integrase-LEDGF/p75 interaction using the AlphaScreen luminescent proximity assay［J］.J Biomol Screen，2008，13(5):406－14.

［19］Peat T S，Rhodes D I，Vandegraaff N，et al.Small molecule inhibitors of the LEDGF site of human immunodeficiency virus integrase identified by fragment screening and structure based design［J］.PLoS One，2012，7(7):e40147.

［20］Wagstaff K M，Rawlinson S M，Hearps A C，Jans D A.An AlphaScreen(R)-based assay for high-throughput screening for specific inhibitors of nuclear import［J］.J Biomol Screen，2011，16(2):192－200.

［21］He H Q，Ma X H，Liu B，et al.High-throughput real-time assay based on molecular beacons for HIV-1 integrase 3'-processing reaction［J］.Acta Pharmacol Sin，2007，28(6):811－7.

［22］何紅秋，劉 斌，陳慰祖，王存新.分子信標(biāo)方法研究HIV-1整合酶3'加工反應(yīng)動力學(xué)［J］.中國生物工程雜志，2012，32(2):76－81.

［22］He H Q，Liu B，Chen W Z，Wang C X.Kinetic study of the HIV-1 Integrase 3'-processing reaction using a molecular beacons based assay［J］.Chin Biotechnol，2012，32(2):76－81.

［23］Van Loock M，Meersseman G，Van Acker K，et al.A novel highthroughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors［J］.J Virol Methods，2012，179(2):396－401.

［24］Rosenbluh J，Hayouka Z，Loya S，et al.Interaction between HIV-1 Rev and integrase proteins-A basis for the development of anti-HIV peptides［J］.J Biol Chem，2007，282(21):15743－53.

［25］Belshan M，Schweitzer C J，Donnellan M R，et al.In vivobiotinylation and capture of HIV-1 matrix and integrase proteins［J］.J Virol Methods，2009，159(2):178－84.

［26］Daelemans D，Pauwels R，De Clercq E，Pannecouque C.A timeof-drug addition approach to target identification of antiviral compounds［J］.Nat Protoc，2011，6(6):925－33.

［27］Tabarrini O，Stevens M，Cecchetti V，et al.Structure modifications of 6-aminoquinolones with potent anti-HIV activity［J］.J Med Chem，2004，47(22):5567－78.

［28］Levin A，Armon-Omer A，Rosenbluh J，et al.Inhibition of HIV-1 integrase nuclear import and replication by a peptide bearing integrase putative nuclear localization signal［J］.Retrovirology，2009，6:112.

［29］Mousnier A，Leh H，Mouscadet J F，Dargemont C.Nuclear import of HIV-1 integrase is inhibited in vitro by styrylquinoline derivatives［J］.Mol Pharmacol，2004，66(4):783－8.

［30］Du L，Zhao Y，Chen J，et al.D77，one benzoic acid derivative，functions as a novel anti-HIV-1 inhibitor targeting the interaction between integrase and cellular LEDGF/p75［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，375(1):139－44.

［31］Zhang X，Yang L M，Liu G M，et al.Potent anti-HIV activities and mechanisms of action of a pine cone extract from Pinus yunnanensis［J］.Molecules，2012，17(6):6916－29.

［32］Chow S A.In vitroassays for activities of retroviral integrase［J］.Methods，1997，12(4):306－17.

［33］Brussel A，Delelis O，Sonigo P.Alu-LTR real-time nested PCR assay for quantifying integrated HIV-1 DNA［J］.Methods Mol Biol，2005，304:139－54.

［34］Friedrich B，Li G Y，Dziuba N，F(xiàn)erguson M R.Quantitative PCR used to assess HIV-1 integration and 2-LTR circle formation in human macrophages，peripheral blood lymphocytes and a CD+4cell line［J］.Virol J，2010，7:354.

［35］Butler S L，Hansen M S，Bushman F D.A quantitative assay for HIV DNA integrationin vivo［J］.Nat Med，2001，7(5):631－4.

［36］Vaisocherova H，Snasel J，Springer T，et al.Surface plasmon resonance study on HIV-1 integrase strand transfer activity［J］.Anal Bioanal Chem，2009，393(4):1165－72.

［37］Ma S K，Wu K Z，Li A X.Virtual screening for natural product inhibitors of HIV-1 integrase［J］.Interdiscip Sci，2011，3(1):17－21.

［38］Liao C，Karki R G，Marchand C，et al.Virtual screening application of a model of full-length HIV-1 integrase complexed with viral DNA［J］.Bioorg Med Chem Lett，2007，17(19):5361－5.

［39］Tintori C，Manetti F，Veljkovic N，et al.Novel virtual screening protocol based on the combined use of molecular modeling and electron-ion interaction potential techniques to design HIV-1 integrase inhibitors［J］.J Chem Inf Model，2007，47(4):1536－44.

［40］Ko G M，Reddy A S，Garg R，et al.Computational Modeling Methods for QSAR Studies on HIV-1 Integrase Inhibitors(2005－2010)［J］.Curr Comput Aided Drug Des，2012，79:835－9.