王晶晶， 紀(jì)會會， 焦 山

（合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)系，安徽 合肥230601）

1 引言

動物線粒體DNA呈共價閉環(huán)雙鏈結(jié)構(gòu)，在一級結(jié)構(gòu)上，其進(jìn)化速率為核DNA的5～10倍，絕大多數(shù)都表現(xiàn)為母系遺傳。其基因組結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定、簡單、無組織特異性、便于分析，而且容易純化得到，使其成為研究動物起源進(jìn)化及群體遺傳分析的理想的研究對象［1－2］。堿基序列分析雖然技術(shù)要求高，花費大，但通過測定線粒體DNA全序列或部分基因片段序列可以了解堿基的置換、缺失、插入等實際情況，并可比較不同物種或個體堿基相關(guān)序列的差異，從而探討進(jìn)化關(guān)系，因此比其他分析方法具有很大的優(yōu)點，目前已被應(yīng)用到分類進(jìn)化領(lǐng)域研究中［3－4］。

M.和S.Nass發(fā)現(xiàn)線粒體DNA（mtDNA）后，又發(fā)現(xiàn)線粒體DNA還能合成12S和16SrRNA及22種tRNA，隨著分子系統(tǒng)學(xué)以及DNA分子技術(shù)的發(fā)展，從DNA水平研究物種間親緣關(guān)系以及進(jìn)行物種輔助鑒定已經(jīng)逐漸成為一種新的手段［3－6］。已知動物線粒體DNA（mtDNA）具有分子量小、母性遺傳以及比核基因DNA進(jìn)化速度快等特點，其中的12S和16SrRNA片段更是保守，所以Hedges and Maxsom （1993）和 Hay et al.（1995）便提出了線粒體12S和16SrRNA基因可以用于研究兩棲動物系統(tǒng)發(fā)育［7］，不少學(xué)者做了大量的工作?，F(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于種內(nèi)和種間系統(tǒng)發(fā)育研究中，尤其在蛙科的系統(tǒng)發(fā)育方面［7－8］。

兩棲動物是從水生到陸生進(jìn)化上的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在系統(tǒng)進(jìn)化上具有承前啟后的重要作用［9］。兩棲類是脊椎動物進(jìn)化從水生到陸生重大轉(zhuǎn)變過程中的一個過渡類群，在地球生命進(jìn)化研究中占有重要地位?；ǔ敉埽≧ana schmackeri）隸屬兩棲綱（Amphibia）、無尾目（Anura）、蛙科（Ranidae），鼓膜大，約為第三指吸盤的2倍［10］；上眼瞼、體后背部及后肢背面均無小白刺，體側(cè)無背側(cè)褶；指、趾具吸盤，縱徑大于橫徑，均有腹側(cè)溝；體背面為綠色，間以棕褐色或褐黑色大斑點，多近圓形并鑲以淺色邊［9－10］；分布于江蘇、浙江、安徽、福建、江西、河南、湖北、湖南、廣東、廣西、四川、貴州、陜西、甘肅等地，多見于較開闊的山溪及附近潮濕處以及常蹲在有苔蘚的巖石上，其生存的海拔范圍為200至1500米，是中國的特有物種［10］。

在具有獨特進(jìn)化地位的兩棲類動物中，對系統(tǒng)進(jìn)化上的保守性狀進(jìn)行深入研究，將有助于花臭蛙的系統(tǒng)分化與分類問題提供依據(jù)［11－13］。本實驗是通過測定花臭蛙線粒體12S和16SrRNA基因序列，再利用ClustalX軟件分析與其他相關(guān)物種（例如：黑斑蚊、花臭蛙、天臺蛙）的同源關(guān)系，為將來花臭蛙的分類提供分子生物學(xué)方面的證據(jù)。

2 材料和方法

2.1 材料

實驗所用的花臭蛙于2011年6月采自安徽黃山自然保護區(qū)海拔500米附近的山溪，置－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實驗主要試劑：購買自TIANGEN的TIANa－mp Genomic DNA Kit、Ex Taq 酶、dNTPs、1000bpLadder、10×Ex Taq緩沖液。

2.2 方法

2.2.1 基因組DNA的提取

取0.1g花臭蛙肌肉組織，利用TIANGEN公司的TIANamp Genomic DNA Kit提取其基因組DNA。將乙醇沉淀后DNA溶解于50μL滅菌蒸餾水，測定DNA濃度后于4℃存放。為防止DNA污染，在基因組DNA提取過程中，以陰性作為對照，用TE溶液代替溶解樣品。為避免交替污染，DNA提取分3次在不同的時間進(jìn)行。

2.2.2 引物設(shè)計及PCR擴增

根據(jù)從GenBank檢索到的其它相關(guān)蛙科物種的12S和16SrRNA基因序列，分別設(shè)計花臭蛙12S和16SrRNA基因引物：

12SrRNA——F 5′－GAACTACGAGCC－3′，12SrRNA——R 5′－GTGTACGCGTCC－3′；

16SrRNA—F 5′－UGAGCAUAGUUG — 3′，16SrRNA—R 5′－AUAGGAUCAC－3′。在PCR儀（Backman）上進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)總體積為25μL，包括：濃度20～50μmol／μL引物各1μL，10×Ex Taq 緩沖液（TIANGEN）2.5μL，dNTPs（TIANGEN）2μL，1Lg模板 DNA 1μL，Ex Taq 酶（TIANGEN）1.25U，其它為滅菌蒸餾水。PCR反應(yīng)程序如下：12SrRNA（94℃預(yù)變性300s，然后94℃變性45s，45℃退火45s，72℃延伸45s，35個循環(huán)，最后72℃延伸420s）；16SrRNA（95℃預(yù)變性5min，95℃變性30 s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)次數(shù)為30。循環(huán)結(jié)束后再72℃延伸10min）。用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增片段大小，溴化乙錠染色，紫外透射儀觀察并照相記錄。

2.2.3 序列測定

觀察到條帶后將樣品送至上海生工進(jìn)行花臭蛙12S和16SrRNA基因片段的序列測定。

2.2.4 數(shù)據(jù)分析

利用DNASTAR軟件對測得的12S和16S rRNA基因序列進(jìn)行編輯排序和計算，再利用ClustalX軟件分析其與黑斑蛙（Rana nigromaculata，GenBank登陸號：JN541318.1）、天臺蛙（Rana tientaiensis，GenBank登陸號：AF205560.1）、大壁虎（Gekko gecko，GenBank登陸號：DQ093192）、卡氏小鼠 （Mus caroli，GenBank 登陸號：JQ287760.1）、大猩猩（Gorilla gorilla，GenBank登陸號：AJ627520.1）以及人（Homo sapiens，Gen－Bank登陸號：AF121220.1）的同源關(guān)系。

3 結(jié)果與分析

3.1 花臭蛙線粒體12S和16SrRNA基因片段的PCR擴增

利用GenBank檢索到的其它相關(guān)蛙科物種的12S與16SrRNA基因序列設(shè)計的簡并引物進(jìn)行花臭蛙線粒體基因12S和16SrRNA片段的PCR擴增，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，可見清晰的特異性擴增條帶，長度與預(yù)期一致，而且空白對照試驗未出現(xiàn)擴增產(chǎn)物。（圖1是擴增結(jié)果）

圖1 花臭蛙線粒體12S與16SrRNA基因片段PCR擴增結(jié)果

3.2 花臭蛙線粒體12S和16SrRNA基因片段序列的測定

測定出花臭蛙（Rana schmackeri）線粒體基因12SrRNA 347bp的基因片段（如下圖2），其中A、T、G 、C 的含量分別是 105bp（30.26%），78bp（22.48%），76bp（21.90%），88bp（25.36%）。A＋T含量為52.74%，C＋G含量為47.26%。

圖2 檢測得到的花臭蛙的線粒體12SrRNA基因序列

花臭蛙16SrRNA序列長度為380bp（如下圖3），對測序結(jié)果統(tǒng)計4種堿基（A、G、C、T）在核苷酸序列中的平均含量，發(fā)現(xiàn)A、G、C、T含量分別為：31.8% （121 個）、20.8% （79 個）、25.8% （98個）、21.6%（82個）；其中 G＋C為47%，A＋T為53%。

圖3 檢測得到的花臭蛙的線粒體16SrRNA基因序列

3.3 線粒體12S和16SrRNA基因序列堿基組成的比較

根據(jù)現(xiàn)有的研究，通過測定動物的線粒體基因全序列或者部分序列，再相比較物種或個體堿基序列差異可以研究探進(jìn)化關(guān)系。在GenBank中下載了大綠蛙（Rana livida）、黑斑蛙（Rana nigromaculata）、天 臺 蛙 （Rana tientaiensis）、林 蛙 （Rana chensinensis）及大蹼林蟾（Bombina maxima）的線粒體12S和16SrRNA同源序列進(jìn)行進(jìn)行分析比對（見表1、表2）。

表1 四種蛙的12SrRNA基因序列的堿基構(gòu)成情況

表2 四種兩棲類物種16SrRNA基因片段堿基組成

在表1中，大綠蛙、黑斑蛙和天臺蛙的序列長度分別為347bp、350bp、386bp，其 A、T、C、G 的含量分 別 為 29.11%、23.34%、25.36%、22.19%；31.31%、22.98%、26.52%、19.19%；30.57%、21.50%、27.46%、20.47%。經(jīng)試驗測定得到的花臭蛙347bp的序列中 A、T、C、G的含量分別為30.26%、22.48%、25.36%、21.90%。與上面三種蛙的線粒體12SrRNA序列對比之后不難發(fā)現(xiàn)，花臭蛙、大綠蛙、黑斑蛙和天臺蛙四種種蛙中A＋T的含量平均值十分相近，在52.07%～54.29%之間，略高于C＋G的含量（47.26%～47.93%）。

同理，將花臭蛙16SrRNA的序列與大綠蛙、林蛙及大蹼鈴蟾的序列進(jìn)行分析（見表2），經(jīng)計算各個堿基在相應(yīng)的基因片段所占比例相似，且A＋T的含量也都大于G＋C的含量。直接反映出了以上四個物種具有較高同源性，也表明16SrRNA在蛙科進(jìn)化中的保守性。

3.4 花臭蛙與其它物種的同源性比較

利用ClustalX軟件，從GENBANK下載一些物種的相關(guān)序列，分別對花臭蛙的12S和16S進(jìn)行序列的同源性分析（見表3、表4），可得到花臭蛙線粒體12SrRNA與天臺蛙的相關(guān)序列同源性為80.45%，與魚類中的黯紋東方鲀相關(guān)序列的同源性63.25%，與爬行類四線棉蛇的相關(guān)序列的部分片段同源性為65.43%，與哺乳類家鼠相關(guān)基因的同源性為66.34%。

表3 花臭蛙與其他物種12SrRNA基因的同源性比較

花臭蛙16SrRNA基因與同為兩棲類蛙屬的天臺蛙（Rana tientaiensis）同源性高達(dá)86%，與爬行類的大壁虎（Gekko gecko）同源性為74%，與四線棉蛇（Elope quatuorlineata）的同源性為78%，與魚類的斑馬魚（Danio rerio）同源性為68%，與哺乳類家鼠的同源性為65%。

表4 花臭蛙與其他物種16SrRNA基因的同源性比較

4 討論

4.1 用線粒體基因研究的意義

線粒體基因能夠獨立地進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，且分子量小，結(jié)構(gòu)較簡單，使得其更容易從組織中分離、提純；線粒體基因mtDNA因其母系遺傳、無內(nèi)含子、缺少重組的遺傳物質(zhì)，而常被用于物種的系統(tǒng)進(jìn)化和分類地位的研究［13－14］。其中，16SrRNA 基因進(jìn)化程度適中，通過堿基序列分析，再與其它相關(guān)物種進(jìn)行同源性分析，比較差異，來探討進(jìn)化關(guān)系，其常作為分子標(biāo)記用于哺乳動物、鳥、兩棲、爬行類等物種系統(tǒng)進(jìn)化的研究［15］。

4.2 花臭蛙與其它物種12S和16SrRNA的同源性分析

利用ClustalX軟件將花臭蛙與相關(guān)物種的目的片段進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示：花臭蛙與天臺蛙的同源性最高，達(dá)到了（12SrRNA達(dá)到80.45%，16SrRNA達(dá)到86%），而與爬行類的四線棉蛇等相關(guān)物種具有較高的同源性（12SrRNA達(dá)到65.43%，16SrRNA達(dá)到65%），與哺乳類的家鼠、魚類的斑馬魚具有一定的同源性（與家鼠的12S rRNA達(dá)到66.34%，16SrRNA達(dá)到65%），這與兩棲類內(nèi)部親緣關(guān)系較近，兩棲類與其它相關(guān)物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)相符合，符合物種的進(jìn)化規(guī)律，下一步可通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹來研究花臭蛙在蛙科分類中的關(guān)系和地位［16－18］。

4.3 展望

隨著DNA的序列分析、PCR技術(shù)的應(yīng)用，mtDNA在動物起源、種群分化等方面已經(jīng)取得了具有應(yīng)用價值的成果。mtDNA的堿基序列分析雖然是個浩大的工程，不僅花費很高，技術(shù)要求也很高，但mtDNA進(jìn)化速度適中，基因高度保守，通過測定物種個體mtDNA的堿基序列，然后與其它相關(guān)物種的堿基序列進(jìn)行同源性分析，比較差異，來探討物種的進(jìn)化地位，這相對于其它分析方法，具有很大的優(yōu)勢［1－4］。

目前在我國，兩棲動物的生存現(xiàn)狀不容樂觀，部分甚至有瀕臨滅絕的危險。我們可通過分子生物學(xué)方面的手段來研究動物線粒體基因，了解物種的生物學(xué)特性，從而制定出相應(yīng)的保護措施，緩解物種的滅絕趨勢［8－11］。

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