方 雪

（合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)系，安徽 合肥230601）

水稻是世界主要糧食作物之一，占世界糧食作物產(chǎn)量的40%［1］。近年來，水稻基因組研究進展迅速，隨著水稻全基因組序列的測序的的完成，水稻分子生物學(xué)研究進入功能基因組時代［2－3］。水稻節(jié)間生長發(fā)育有著特定的時空模式，有多個基因參與調(diào)控水稻節(jié)間發(fā)育［4，5］。

Takeda曾將水稻矮桿突變體依據(jù)其對節(jié)間排布模式的影響而分為五類：dn、dm、d6、sh、nl。其中dn型水稻突變體中每個節(jié)間均勻縮短，其伸長形式跟野生型相似；dm型突變表現(xiàn)為第二節(jié)間特異縮短；sh和d6型突變體則是倒一節(jié)或是倒二節(jié)縮短［6］。隨著近年來水稻功能基因組研究的迅猛發(fā)展，許多與這五類突變相關(guān)的基因已被鑒別和克隆。已克隆出的基因OSH15、OSBRI1的突變可以造成d6表型［7］；本研究中克隆的OEUI的突變可以造成sh表型。多個EUI基因則特異調(diào)控倒一節(jié)的伸長模式。對這些基因的克隆以及相關(guān)的生物學(xué)研究將極大地促進人們理解水稻節(jié)間模式形成的分子機理［8，9］。

經(jīng)典的植物學(xué)研究早已表明植物激素赤霉素對于節(jié)間的伸長是必須的，EUI基因還與赤霉素的合成代謝以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，許多與赤霉素合成、代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的突變體都表現(xiàn)出節(jié)間伸長的缺陷［10］。另外，油菜素內(nèi)酯和生長素都對節(jié)間的伸長有著重要的作用［11］。因此，可以利用節(jié)間伸長探討赤霉素、油菜素內(nèi)酯和生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間的關(guān)系。水稻生產(chǎn)中，水稻雄性不育系中普遍存在的“包頸”現(xiàn)象（即倒一節(jié)間伸長受阻），印證了在頂端發(fā)育的穗與倒一節(jié)間的居間分生組織之間存在長距離信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)［12］。在已克隆的基因中，OSH15編碼了一個同源異形盒（homeo－domain）蛋白；OSBRI1編碼的蛋白是油菜素內(nèi)酯的受體，OSH15、OSBRI1的突變可以造成相似的d6表型，提示激素BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與同源異形盒基因之間的互作關(guān)系［13，14］。

圖位克隆是近年來隨著各種植物的分子標(biāo)記圖譜的相繼建立而發(fā)展起來的一種新的基因克隆技術(shù)。根據(jù)功能基因在基因組中都有相對較穩(wěn)定的基因座，在利用分子標(biāo)記技術(shù)對目的基因進行精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選DNA文庫（包括 YAC、BAC、TAC、PAC或cosmid文庫），從而構(gòu)建目的基因區(qū)域的物理圖譜，再利用此物理圖譜通過染色體步移逐步逼近目的基因或通過染色體登陸的方法最終找到包含該目的基因的克隆，并通過遺傳轉(zhuǎn)化實驗證實目的基因的功能［15］。2003年朱宏波用圖位克隆的策略將EUI2基因定位于一個41.7kb的區(qū)間內(nèi)，并成功克隆到該基因。僅知道EUI2同樣與赤霉素有關(guān)，但對EUI2的功能研究尚未見報道［16］。

目前幾乎所有重要農(nóng)作物，如水稻、擬南芥、番茄、玉米、甜菜、小麥、大豆、馬鈴薯、棉花、油菜等的RFLP圖譜均已構(gòu)成，隨著多種標(biāo)記的不斷添加與定位，分子遺傳圖譜正日漸趨于飽和。2001年Cornell大學(xué)發(fā)表的SSR遺傳連鎖圖上SSR標(biāo)記達(dá)到500多個，而2002年IRMI圖譜上則整合了2240個新開發(fā)的SSR標(biāo)記。水稻全基因組序列的完成，為水稻分子遺傳學(xué)研究提供無窮的分子標(biāo)記和序列信息，必將對水稻基因圖位克隆技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生了巨大的推動作用。

本研究中的OEUI基因的表型為水稻倒一節(jié)伸長受阻，該表型由γ射線誘變水稻種子得到，為單基因隱性突變。為深入研究該基因的功能，采用圖位克隆法，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，依靠PCR擴增進行全基因組掃描，確定OEUI基因在染色體中的位置，尋找與OEUI基因連鎖的遺傳標(biāo)記，最終對OEUI基因進行精細(xì)定位，從而研究其功能。

1 材料與方法

1.1 定位群體的構(gòu)建和總DNA的提取

通過對本實驗室所構(gòu)建的水稻突變體庫進行大規(guī)模篩選，獲得一穩(wěn)定遺傳的單基因隱性突變體oeui。oeui為輻射處理野生型中花11（ZH11）的種子產(chǎn)生誘變獲得。以oeui突變體和龍?zhí)馗Γ↙TF）為親本構(gòu)建F2群體，用于OEUI基因的初步定位。從F2代中選取30株顯性正常株和54株突變株構(gòu)成定位群體，分單株取葉片提取總DNA。在此基礎(chǔ)上隨機選取正常株和突變株各10株，取等量葉片，混合研磨后提取DNA，建成混合池。參照 Mc－Couch等的方法提取總DNA［17］。

1.2 篩選與目標(biāo)基因連鎖的SSR標(biāo)記

利用日本水稻基因組計劃（RGP）公布的1號染色體的有關(guān)信息，設(shè)計并合成SSR引物。對突變體oeui和正常株的基因組DNA分別進行擴增，PCR按常規(guī)方法進行。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。如果PCR產(chǎn)物在親本間具有多態(tài)性，直接用作分子標(biāo)記；如果沒有多態(tài)性，則將擴增產(chǎn)物用不同的限制性核酸內(nèi)切酶進行酶切，并用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，表現(xiàn)多態(tài)者則用作SSR分子標(biāo)記。

1.3 基因初定位

用開發(fā)出的SSR標(biāo)記對龍?zhí)馗Γ痮eui突變體F2群體中的突變體進行分析，將OEUI基因所控制的性狀按雙親表型分為2群，每一群中各個體DNA等量混合，形成2個DNA混合池（倒一節(jié)間伸長和倒一節(jié)間伸長受阻）。用OEUI基因附近的SSR標(biāo)記對混合DNA樣品池進行分析，根據(jù)基因池中包含有交換的DNA池的比例確定與OEUI基因連鎖最緊密的分子標(biāo)記和OEUI基因附近所有分子標(biāo)記的順序。SSR標(biāo)記的分析結(jié)果利用Mapmaker 3.0作圖軟件進行連鎖分析及遺傳距離計算。

1.4 基因精細(xì)定位

以oeui突變體和廣陸矮4號（GLA4）為親本構(gòu)建F2群體，用于OEUI基因的精細(xì)定位。把目標(biāo)基因初步定位在2個標(biāo)記之間后，從國際水稻基因組測序計劃（IRGSP）公布的序列中下載這2個標(biāo)記區(qū)域的部分SSR標(biāo)記。對擴增良好并表現(xiàn)出多態(tài)性的引物分別在定位群體中的oeui突變株上作分析，將目標(biāo)基因范圍縮小到一個很小的基因組區(qū)域并應(yīng)用于精細(xì)定位分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OEUI基因初步定位群體的構(gòu)建：

OEUI基因初步定位群體來源于龍?zhí)馗Γ↙TF）／oeui突變體的F2中的突變表型株，共64株。突變體植株矮化，倒一節(jié)間生長受阻，突變體不結(jié)實。形態(tài)特征如圖1。

圖1 突變體與其野生型親本的植株形態(tài)

2.2 OEUI基因連鎖引物的篩選

隨機挑選10株突變體，構(gòu)建DNA混合池，以中花11、龍?zhí)馗Α1、DNA混合樣為模板，全基因組掃描，發(fā)現(xiàn)水稻第一染色體標(biāo)記RM3252可能與基因OEUI連鎖，用RM3252擴增64株龍?zhí)馗Γ痮eui突變體的F2中的突變表型株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有三株表現(xiàn)F1帶型，即為交換單株（圖2），其余均與中花帶型一致，因此認(rèn)為SSR標(biāo)記RM3252與OEUI基因連鎖。

圖2 標(biāo)記RM3252對部分LTF／oeui的F2突變株DNA的PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖（含箭頭所指帶型的單株為交換株）

2.3 OEUI基因的初步定位

用64株LTF／oeui突變體將OEUI基因初步定位在RM4554與RM5552之間，它們之間的遺傳距離約14.8cm。

2.4 OEUI基因的精細(xì)定位

OEUI基因的精細(xì)定位群體來源于廣陸矮4號（GLA4）／oeui突變體的F2中的突變表型株，共504株。

在初定位的基礎(chǔ)上進一步在RM4554與RM5552之間發(fā)展SSR分子標(biāo)記，在親本表現(xiàn)多態(tài)的有效引物有八對，分別為：RM3148，RSL0126／0127，RSL0114／0115，RSL0108／0109，RSL0160／0161，RSL0168／0169，RSL0172／0173與 RSL0152／0153。其中RSL0126／0127是在緊接RM3148后的BAC AP002867 中設(shè)計的，RSL0114／0115，RSL0108／0109是在緊接 AP002867后的 BAC AP002747中設(shè)計的，RSL0160／0161，RSL0168／0169，RSL0172／0173 是在 RM3148 與 RSL0152／0153中部的BAC AP002868中設(shè)計的（圖3）。

圖3 八對有效引物在染色體上的位置

通過擴增504株F2表型突變株發(fā)現(xiàn)：RM3148擴增504株F2突變株，交換單株編號為87，124，164，208，257，297，316，376，共八株（圖4）。

圖4 RM3148對部分GLA4／oeui的F2突變株DNA的PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖

RSL0152／0153擴增504株F2突變株，交換單株編號為12，15，46，66，68，88，110，124，125，128，135，137，161，166，176，185，234，236，251，257，273，283，285，289，291，295，300，317，332，341，347，348，354，358，366，369，370，375，379，390，396，399，433，435，444，450，468，470，共48株。用前八對可用引物擴增RM3148的八株交換單株，結(jié)果如表1。

表1 八對可用引物擴增RM3148的八株交換單株

分析F2群體的504株倒一節(jié)間伸長受阻表型個體，檢測出重組個體并驗證區(qū)間走勢，最終把OEUI基因定位在SSR標(biāo)記RM3148和RSL0152／0153之間，它們之間的物理距離約為876kb，遺傳距離為3.9cm。

3 討論

本研究首先利用64株LTF／oeui突變體，采用集團分離分析法篩選到與OEUI基因連鎖的標(biāo)記RM3252。隨后運用在親本間具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記篩選F2定位群體，將目標(biāo)基因定位在1號染色體上的標(biāo)記RM3148和RSL0152／0153之間。根據(jù)已經(jīng)公布的水稻全基因組序列，查找到標(biāo)記RM3148與SL0152／0153之間的基因組序列，利用Primer5軟件對查找到的系列進行分析，尋找可以利用的微衛(wèi)星，設(shè)計合成新的SSR標(biāo)記。最后利用新發(fā)展的6對可用標(biāo)記擴增RSL0152／0153的48株交換單株，繼續(xù)縮小兩個側(cè)翼標(biāo)記間的距離，這進一步克隆該基因奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)然，為了證實該候選基因就是OEUI，還需要進行遺傳互補實驗。進一步進行OEUI基因的功能分析，研究赤霉素的合成代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及節(jié)間模式形成的分子機理。

一般而言，精細(xì)定位在圖位克隆中時一個限速步驟。隨著目標(biāo)染色體區(qū)域的逐漸縮小，尋找分子標(biāo)記的難度越來越大。因此，采取合適的方法來發(fā)掘多態(tài)標(biāo)記是非常重要的。在本研究中，我們嘗試了多種分子標(biāo)記技術(shù)，包括CAPS、SNP和SSR。相對而言，SSR比較適用，但數(shù)量較少，開發(fā)費用較高。根據(jù)我們的經(jīng)驗，最有效的還是SSR。利用這種方法開發(fā)SSR標(biāo)記效率較高，費用較低，適合于基因精細(xì)定位的需要。

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