周世敏 李艷萍 鄔伶仟 劉冬娥 劉能輝 姚仲元 陳仙花 張葉青

本文將對(duì)本院2010年1月1日-2012年9月30日近三年來(lái)進(jìn)行體外受精-胚胎移植治療的夫婦進(jìn)行臨床研究，從而探討精液體外處理方法及技巧，為臨床提高體外受精-胚胎移植治療不孕不育癥患者療效以及優(yōu)質(zhì)胚胎率提供可靠依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本文將對(duì)本院2010年1月1日-2012年9月30日近三年來(lái)進(jìn)行體外受精-胚胎移植治療的夫婦進(jìn)行臨床研究，其中2010年1402例，男平均（31.4±0.5）歲，女平均（29.7±0.8）歲，不孕不育癥平均病程（5.6±0.5）年；2011 年 1667 例，男平均（31.9±0.5）歲，女平均（30.3±0.7）歲，不孕不育癥平均病程（5.1±0.8）年；2012年1321例，男平均（32.1±0.6）歲，女平均（30.5±0.8）歲，不孕不育癥平均病程（5.2±0.6）年。2010年IVF-ET取卵周期數(shù)為1402例、2011年1667例、2012年（1-9月）1321例。

1.2 方法 對(duì)2010年1月1日-2012年9月30日近三年來(lái)進(jìn)行體外受精-胚胎移植治療的夫婦臨床資料進(jìn)行回顧性分析，2010年取卵周期數(shù)為1402例實(shí)施部分上游法及部分密度梯度離心法對(duì)精液進(jìn)行處理；2011年取卵周期數(shù)為1667例實(shí)施大部分梯度密度離心法+上游法以及少部分上游法對(duì)精液進(jìn)行處理；2012年取卵周期數(shù)為1321例實(shí)施全部梯度密度離心+上游法對(duì)精液進(jìn)行處理。觀察并記錄各年份患者受精情況，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出結(jié)論。

1.2.1 采樣處理 女方給予常規(guī)促排卵方案，于體內(nèi)卵泡發(fā)育成熟后對(duì)其肌肉注射人絨毛膜促性腺激素（即hCG）[1]，劑量為5000或10 000 IU，32～36 h后，經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下對(duì)女方進(jìn)行穿刺取卵[2]。男方于女方取卵當(dāng)日通過(guò)手淫法取精液[3]，取精液前男方禁欲3～7 d[4]，將精液收集在無(wú)菌塑料杯中液化后待用。

1.2.2 上游法[5]取將液化后的精液，加入2～3 ml Vitorlife公司生產(chǎn)的HTF洗滌液進(jìn)行混合，之后以每分鐘2000轉(zhuǎn)速度離心3～5 min，棄上清液后加入試管底部并在上層加入2 ml培養(yǎng)液，經(jīng)濃度為5%、37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中上游30～40 min，之后取上清液離心3～5 min，棄上清液后待用。

1.2.3 密度梯度離心+上游序貫法[6]對(duì)精液進(jìn)行處理，選用Vitorlife公司生產(chǎn)的Isolate梯度分離液，在15 ml圓錐離心管首先將濃度為90%、劑量為1 ml的Isolate分離液注入，之后在其上方加入濃度為45%、劑量為1 ml的Isolate分離液，最上層也輕輕緩慢加入液化的精液，離心速度為每分鐘2000轉(zhuǎn)離心10 min棄上清，用劑量為2 ml的HTF洗滌液把上述所得沉淀物輕輕混勻，離心速度為每分鐘2000轉(zhuǎn)離心3～5 min棄上清，下懸液加入試管底部，在上面加入2 ml培養(yǎng)液，于濃度為5%、37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中上游30～40 min將其吸出，每分鐘2000轉(zhuǎn)速度離心3～5 min，棄上清后待用。

1.2.4 受精措施 患者取卵完成后，對(duì)其進(jìn)行黃體酮肌肉注射以便支持黃體[7]，于胚胎移植完成2周后進(jìn)行尿液試驗(yàn)，結(jié)果為人絨毛膜促性腺激素呈陽(yáng)性，于4周后對(duì)患者進(jìn)行B超臨床醫(yī)學(xué)影像觀察，若患者體內(nèi)出現(xiàn)妊娠囊及胎心搏動(dòng)，則可確診為臨床妊娠[8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

體外受精-胚胎移植治療結(jié)果分析，見(jiàn)表1。由表1可知，本院自2010年-2012年，臨床妊娠成功率呈現(xiàn)出逐年上升趨勢(shì)，結(jié)果比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 近三年內(nèi)體外受精-胚胎移植治療不孕不育癥結(jié)果分析

3 討論

目前臨床上常借助輔助生殖技術(shù)對(duì)不孕不育癥患者進(jìn)行治療，常規(guī)治療方法為體外受精-胚胎移植（簡(jiǎn)稱IVF-ET）[9]。臨床研究表明，對(duì)不孕不育癥患者進(jìn)行IVF-ET技術(shù)治療時(shí)，由于實(shí)施卵漿內(nèi)單精子注射（簡(jiǎn)稱ICSI）方式，精子將繞過(guò)自然選擇過(guò)程，直接被注入卵母細(xì)胞內(nèi)，因此部分發(fā)生遺傳物質(zhì)受損的精子有可能直接注入卵子內(nèi)部，從而對(duì)胚胎發(fā)育造成影響，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致患者孕育后代時(shí)出現(xiàn)遺傳風(fēng)險(xiǎn)，造成嚴(yán)重后果[10]。

應(yīng)用精液體外處理注意事項(xiàng)：在取精前數(shù)月，男方應(yīng)戒煙酒，生活有規(guī)律，如有生殖系統(tǒng)炎癥需積極治療。進(jìn)入治療周期后，根據(jù)醫(yī)囑在估計(jì)取卵前3～7 d，其丈夫需排精一次，然后禁欲，直至取卵日，精液在體內(nèi)存留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短會(huì)影響精子質(zhì)量。首先用清水洗凈雙手，陰莖，外陰等，然后手淫法留取精液時(shí)所用小杯為無(wú)菌消毒，留取時(shí)不要觸摸杯緣及杯內(nèi)。取精后對(duì)其進(jìn)行液化后應(yīng)盡快使用，其原因?yàn)橐夯瘯r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，精子核易出現(xiàn)空泡現(xiàn)象，影響精子質(zhì)量，精子核空泡的形狀和數(shù)目對(duì)囊胚的發(fā)育有負(fù)面影響，精子頭部的空泡可能與移植后的流產(chǎn)率相關(guān)。由于人精子頂體部含有大量不飽和脂肪酸，并且缺乏抗氧化機(jī)制，處理精液時(shí)較大的離心力可增加精子產(chǎn)生過(guò)多氧自由基（ROS）而損傷精子功能，特別是促使精子的DNA氧化變性，因此在對(duì)精液行離心時(shí)應(yīng)盡量減少離心時(shí)間及轉(zhuǎn)數(shù)，從而盡量避免精液中精子損傷情況發(fā)生。

在本次研究過(guò)程中對(duì)精液應(yīng)用洗滌液進(jìn)行洗滌目的為：（1）去除精液中的前列腺素及其他可引起子宮痙攣及疼痛的物質(zhì)。（2）去除精液中可引起感染及其他副作用的細(xì)菌和化學(xué)物質(zhì)。（3）增加了精子的獲能，從而增強(qiáng)其受孕能力。（4）有可能去除影響精子功能的抗體。

Pereoll法和Isolate法是臨床常用的精液體外梯度密度離心處理方法，但I(xiàn)solate法處理效果優(yōu)于Pereoll法，其原因?yàn)椋海?）Percoll中含有聚乙烯吡咯烷酮在離心過(guò)程中可加速精子膜過(guò)氧化反應(yīng)導(dǎo)致DNA完好性受損；（2）Isolate精子分離液是一種非連續(xù)液態(tài)過(guò)濾膜，為二氧化硅以共價(jià)鍵形式交錯(cuò)聯(lián)結(jié)于Hepes-HTF，是經(jīng)特殊處理的懸浮膠體密度梯度介質(zhì)，可有效減少細(xì)胞污染，與待分離精子不發(fā)生反應(yīng)，不易使頂體膜蛋白失活[3]，具有保護(hù)精子DNA結(jié)構(gòu)免受損傷作用，另一方面可能是Isolate所含有的二氧化硅膠體兼作支持體與分子篩的作用，對(duì)離心力有緩沖作用，使對(duì)精子潛在的氧化損傷降至最低。

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