卜興江，聶劉旺

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院安徽省重要生物資源保護(hù)與利用研究重點實驗室，蕪湖241000)

在爬行動物中，微衛(wèi)星已經(jīng)被用于遺傳多樣性評估和生態(tài)行為特征研究(如婚配模式和擴(kuò)散模式)等方面［1-2］。盡管微衛(wèi)星標(biāo)記是強(qiáng)有力的研究工具，但微衛(wèi)星位點的開發(fā)過程是費時費力且費用高的工作。因此，科研工作者利用微衛(wèi)星兩端的側(cè)翼序列在基因組中特別是親緣關(guān)系比較近的種間具有保守性這一特點，將某一物種已經(jīng)開發(fā)出的微衛(wèi)星位點應(yīng)用到相近物種的相關(guān)研究工作中，并取得了良好效果，這就使得微衛(wèi)星引物在種間的擴(kuò)增成為可能。有關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記在近緣物種間相互借用的研究報道已有很多。比如，Lin等［3］利用從玳瑁分離鑒定的12個多態(tài)性微衛(wèi)星位點對其它7種龜［太平洋麗龜(Lepidochelys olivacea)、兩爪鱉(Carettochelys insculpta)、紅耳龜(Trachemys scripta elegans)、蠵龜(Caretta caretta)、大鱷龜(Macrochelys temminckii)、綠海龜(Chelonia mydas)和黃腹彩龜(Trachemys scripta)］進(jìn)行跨物種擴(kuò)增檢測，結(jié)果表明:在不同的龜種中，最少有8個微衛(wèi)星位點能擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物，最多的12個微衛(wèi)星位點全部能擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物。Dubut等［4］用來自歐洲鯉科15個種的503個個體對41個微衛(wèi)星位點跨物種擴(kuò)增情況進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這41個微衛(wèi)星位點中，24～37個微衛(wèi)星位點在不同物種中具有多態(tài)性，23個微衛(wèi)星位點在所有的15個物種中都具有多態(tài)性?？梢?，借用相近物種微衛(wèi)星標(biāo)記既降低了費用，又省時省力;而且提高了微衛(wèi)星的利用效率，為微衛(wèi)星的推廣應(yīng)用提供了條件，這對于極度瀕危物種研究意義更大。本研究擬對中華鱉新開發(fā)的21個微衛(wèi)星位點進(jìn)行跨物種檢測，共檢測了3科8種，它們是鱉科5個種:黿(Pelochelys cantorii)、斑鱉(Rafetus swinhoei)、山瑞鱉(Palea steindachneri)、刺鱉(Apalone spinifera)和佛羅里達(dá)鱉(Apalone ferox);兩爪鱉科的兩爪鱉(Carettochelys insculpta);淡水龜科的黃喉擬水龜(Mauremys mutica)和烏龜(Chinemys reevesii)。通過本研究以期為還沒有開發(fā)微衛(wèi)星的近緣種，尤其是一些瀕危物種提供這種強(qiáng)有力的研究工具。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 龜鱉類標(biāo)本

本試驗所用龜鱉類標(biāo)本有:黿、斑鱉、山瑞鱉、刺鱉、佛羅里達(dá)鱉、兩爪鱉、黃喉擬水龜和烏龜8只個體均為實驗室保存標(biāo)本。

1.1.2 主要試劑和儀器

Taq DNA聚合酶(TIANGEN);DNA Marker II(TIANGEN)。ICYCLER梯度PCR儀(Bio-Rad);DYY-2C電泳儀;Tan 1600凝膠成像系統(tǒng)。21對微衛(wèi)星引物［5］(表1)由上海生工生物工程公司合成，PAGE膠純化。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

對8種龜鱉標(biāo)本的基因組DNA的提取方法是常規(guī)的酚氯仿方法［6］，提取的基因組DNA經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后拍照。

1.2.2 21對微衛(wèi)星引物的PCR擴(kuò)增檢測

用本實驗室從中華鱉中成功分離得21個微衛(wèi)星位點的引物［5］對上述的8種龜鱉進(jìn)行PCR跨物種擴(kuò)增檢測，反應(yīng)總體積為25 μL。循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s，各引物退火溫度45 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán);72℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后拍照。

表1 中華鱉21個多態(tài)性微衛(wèi)星位點的相關(guān)信息Table 1 The information of 21polymorphic microsatellite loci from Pelodiscus sinensis

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取的電泳檢測結(jié)果

8種龜鱉基因組DNA的提取結(jié)果如圖1所示。1～8分別為:黿、斑鱉、山瑞鱉、刺鱉、佛羅里達(dá)鱉、兩爪鱉、黃喉擬水龜和烏龜所提取的基因組DNA，均顯示無明顯降解現(xiàn)象，提取效果較好，適合進(jìn)行下一步實驗操作。

圖1 8種龜鱉基因組DNA檢測結(jié)果Fig 1 The result of the genomic DNA for eight species of turtle

圖2 跨物種擴(kuò)增電泳檢測圖Fig 2 The PCR products of cross-species amplification

2.2 跨物種擴(kuò)增結(jié)果

21對中華鱉微衛(wèi)星引物對上述的8種龜鱉(黿、斑鱉、山瑞鱉、刺鱉、佛羅里達(dá)鱉、兩爪鱉、黃喉擬水龜和烏龜)進(jìn)行PCR跨物種擴(kuò)增檢測結(jié)果如表2所示;跨物種擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳中的結(jié)果如圖2，除CST16引物在8個物種中都沒有擴(kuò)增成功外，其余的20對引物對8個物種的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測圖見圖2，圖中所示1～8分別為:黿、斑鱉、山瑞鱉、刺鱉、佛羅里達(dá)鱉、兩爪鱉、黃喉擬水龜和烏龜采用不同引物對的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

表2 跨物種擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Cross-species amplification of 21 microsatellite loci

從上表可以看出，就微衛(wèi)星位點而言，4個微衛(wèi)星位點(CST21、CST42、CST50和CST52)引物能在所有8只個體中穩(wěn)定擴(kuò)增;而CST16在所有個體中都不能擴(kuò)增出目的片段。就物種而言，跨物種擴(kuò)增山瑞鱉結(jié)果最好，21個位點中有20個位點能穩(wěn)定擴(kuò)增;而烏龜擴(kuò)增效果最差，只有6個位點能被擴(kuò)增出目的產(chǎn)物。鱉科中的5個物種和其它兩科的3個物種相比，鱉科物種能被擴(kuò)增出目的片段的微衛(wèi)星位點數(shù)明顯的多于另兩科的物種，這也說明鱉科內(nèi)的物種與中華鱉親緣關(guān)系更近，這也符合實際情況。同時，同是鱉科的5個種也分成兩派，黿、斑鱉和山瑞鱉能穩(wěn)定擴(kuò)增的位點數(shù)相似，而刺鱉和佛羅里達(dá)鱉能穩(wěn)定擴(kuò)增的位點數(shù)相似;且前者多于后者，這可能與它們的地理分布有關(guān)系。綜上，中華鱉的21個微衛(wèi)星位點多數(shù)可以在鱉科內(nèi)各屬間進(jìn)行跨物種擴(kuò)增，部分可以在跨科物種間擴(kuò)增。

3 討論

3.1 物種選擇

在進(jìn)行跨物種擴(kuò)增實驗的物種選擇方面，主要基于兩方面考慮:一方面，樣本可獲得性，因為鱉科內(nèi)很多種都是瀕危和極度瀕危物種，如極度瀕危物種斑鱉，目前，全球報道的僅有四只活體，中國有兩只;黿和山瑞鱉屬于瀕危物種?？梢姌颖竞茈y獲得。本實驗室長期從事龜鱉動物研究，經(jīng)過不斷的積累，盡管某些種的個體數(shù)很少，但種類還是比較廣泛的。另一方面，種屬的代表性，鱉科內(nèi)并不是所有屬的種都能得到個體，這樣就選擇在國內(nèi)有分布的種(亞洲范圍內(nèi))，另外選了美洲地區(qū)的兩個種(刺鱉和佛羅里達(dá)鱉)做對比。之所以選擇兩爪鱉科和淡水龜科的物種做跨科比較，主要是因為淡水龜科是現(xiàn)生龜鱉目動物中種類最多、形態(tài)上變異最為多樣的一個自然類群，絕大多數(shù)物種的成種時間都較晚，大約發(fā)生在最近的5000萬年［7-8］;且黃喉擬水龜和烏龜也是分布較廣的種。而兩爪鱉科只有一個種就是兩爪鱉(又叫豬鼻龜)，其在龜鱉目的歸屬存在爭議，Gaffney等［9］基于形態(tài)學(xué)證據(jù)，將其歸入鱉超科;Krenz等［10］基于核重組激活酶基因1(RAG-1)和兩個線粒體基因數(shù)據(jù)分析了24個龜鱉的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了3個系統(tǒng)發(fā)生樹(MP樹、ML樹和BI樹)得到了兩個不同的結(jié)果，MP(Maximum parsimony)樹分析表明可將龜鱉目分成3支:兩爪鱉科(兩爪鱉)，側(cè)頸龜科(非洲側(cè)頸龜)和一支由其它所有現(xiàn)存龜類組成的進(jìn)化支;而 ML(Maximum likelihood)樹和 BI(Bayesian)樹支持將兩爪鱉科和鱉科歸為鱉超科，與曲頸龜亞目其它物種共同構(gòu)成姐妹群。Li等［11］利用線粒體全序列(去除控制區(qū)部分)構(gòu)建了MP樹、ML樹和BI樹，結(jié)果顯示，在MP樹中，龜鱉目被分為3大支:側(cè)頸龜科(Pelomedusidae)，兩爪鱉科(Carettochelyidae)和一支由曲頸龜亞目的18種龜鱉類聚成的進(jìn)化支，此結(jié)果支持將兩爪鱉科提升到亞目的水平。然而ML樹和BI樹則支持兩爪鱉科和鱉科構(gòu)成姐妹群，再同其它曲頸龜物種共同聚為一支，支持將現(xiàn)今龜鱉類分為兩大支:曲頸龜亞目(Cryptodira)和側(cè)頸亞目(Pleurodira)?？梢妰勺M科歸屬的爭議還有待于采用更多的分子數(shù)據(jù)進(jìn)行深入研究。

綜上所述，如果中華鱉微衛(wèi)星位點不僅能跨物種穩(wěn)定擴(kuò)增，而且具有多態(tài)性，那么為近緣物種的分類地位、進(jìn)化歷史及遺傳多樣的研究提供了極大地便利。由于受到樣本尤其是瀕危和極度瀕危樣本數(shù)量的限制，本研究僅對這幾個種進(jìn)行了引物跨物種PCR檢測，雖然部分引物能穩(wěn)定擴(kuò)增，但是否具有多態(tài)性還需進(jìn)一步檢測，這有待在做相應(yīng)物種研究時加以驗證確定。

3.2 跨物種擴(kuò)增存在的問題

盡管微衛(wèi)星標(biāo)記在近緣物種間相互借用有諸多優(yōu)點和好處，但也不可否認(rèn)微衛(wèi)星引物的跨物種擴(kuò)增也存在一些問題。如異源同形(size homoplasy)現(xiàn)象的存在［12-13］，就是一個眾所周知的跨物種擴(kuò)增所存在的問題。所謂“異源同形”就是指與微衛(wèi)星位點的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度相同，但是遺傳組成不完全相同的等位基因。這些不同等位基因的產(chǎn)生主要是由于重復(fù)側(cè)翼區(qū)的突變事件(刪除或插入)或是由于完全型微衛(wèi)星重復(fù)中斷產(chǎn)生了相同大小等位基因所引起的。微衛(wèi)星的異源同形現(xiàn)象已有許多報道［14-16］，并被認(rèn)為是跨物種擴(kuò)增中最主要的問題;而且隨著物種分歧時間的延長異源同形現(xiàn)象有增加的趨勢［13］。但也有研究認(rèn)為異源同形在種群遺傳學(xué)分析中并不是多大的問題，微衛(wèi)星位點廣泛的變異性可以彌補(bǔ)異源同形現(xiàn)象的發(fā)生［17］?？缥锓N擴(kuò)增除了會出現(xiàn)異源同形問題外，最近，岳根華等［18］對屬于 3個不同科(Clariidae、Heteropneustidae和Pimelodidae)的7個鯰魚物種的微衛(wèi)星跨物種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了序列分析，研究發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增非同源(non-orthologous)產(chǎn)物是微衛(wèi)星跨物種PCR擴(kuò)增的一個新問題，也就是在跨物種擴(kuò)增過程中出現(xiàn)了非同源位點，此位點與原來的微衛(wèi)星位點是完全不同的DNA序列。

可見，微衛(wèi)星跨物種擴(kuò)增產(chǎn)生的非同源產(chǎn)物和等位基因大小異源同形將使系統(tǒng)發(fā)育、群體遺傳學(xué)和進(jìn)化研究明顯復(fù)雜化。因此，在應(yīng)用微衛(wèi)星跨物種擴(kuò)增數(shù)據(jù)之前，最好能對跨物種擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序驗證，以避免非同源產(chǎn)物和異源同形的干擾。

［1］Fantin C，F(xiàn)arias I P，Monjeló L A，et al.Polyandry in the red-headed river turtle Podocnemis erythrocephala(Testudines，Podocnemididae)in the Brazilian Amazon［J］.Genetics and Molecular Research，2010，9:435-440.

［2］Zucoloto R B，Villela P M S，Verdade L M，et al.Cross-species microsatellite amplification in South American Caimans(Caiman spp and Paleosuchus palpebrosus)［J］.Genetics and Molecular Biology，2006，29:75-78.

［3］Lin G，Chang A，Yap W，et al.Characterization and cross-species amplification of microsatellites from the endangered Hawksbill turtle(Eretmochelys imbricate)［J］.Conservation Genetics，2008，9:1071-1073.

［4］Dubut V，Sinama M，Martin J F，et al.Cross-species amplification of 41 microsatellites in European cyprinids:a tool for evolutionary，population genetics and hybridization studies［J］.BMC Research Notes，2010，3:135.

［5］Bu X J，Liu L，Wang L，et al.Isolation and characterization of 21 novel polymorphic microsatellite loci in the Chinese soft-shelled turtle Pelodiscus sinensis［J］.Genetics and Molecular Research，2011，10(2):1006-1010.

［6］Sambrook J，Russell D W.Molecular cloning.3rd edn［M］.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001.

［7］Near T J，Meylan P A，Shaffer H B.Assessing concordance of fossil calibration points in molecular clock studies:an example using turtles［J］.The American Naturalist，2005，165:137-146.

［8］Shaffer H B.Turtles(Testudines)，in:Hedges S B and Kumar S.(Eds.)，The Timetree of life［M］.New York:Oxford University Press，2009，398-401.

［9］Gaffney E S，Meylan P A.A phylogeny of turtles.In:Benton，M.J.(Ed.)，The Phylogeny and Classification of Tetrapods［M］.Oxford:Clarendon Press，1988，157-219.

［10］Krenz J G，Naylor G J P，Shaffer H B，et al.Molecular phylogenetics and evolution of turtles［J］.Molecular Phylogenetics and Evolution，2005，37:178-191.

［11］Li X S，Nie L W，Wang L，et al.The mitochondrial genome complete sequence and organization of the pig-nosed turtle carettochelys insculpta(Testudines，Carettochelyidae)and its phylogeny position in Testudines［J］.Amphibia-Reptilia，2010，31:541-551.

［12］Anmarkrud J A，Kleven O，Bachmann L，et al.Microsatellite evolution:mutations，sequence variation，and homoplasy in the hypervariable avian microsatellite locus HrU10［J］.BMC Evolution Biology，2008，8:138.

［13］Estoup A，Tailliez C，Cornuet J M，et al.Size homoplasy and mutational processes of interrupted microsatellites in two bee species，Apis mellifera and Bombus terrestris(Apidae)［J］.Molecular Biology and Evolution，1995，12(6):1074-1084.

［14］Hempel K，Peakall R.Cross-species amplification from crop soybean Glycine max provides informative microsatellite markers for the study of inbreeding wild relatives［J］.Genome，2003，46(3):382-393.

［15］Makova K D，Nekrutenko A，Baker R J.Evolution of microsatellite alleles in four species of mice(genus Apodemus)［J］.Journal of Molecular Evolution，2000，51:166-172.

［16］van Oppen M J H，Rico C，Turner G F，et al.Extensive homoplasy，nonstepwise mutations，and shared ancestral polymorphism at a complex microsatellite locus in Lake Malawi cichlids［J］.Molecular Biology and Evolution，2000，17:489-498.

［17］Estoup A，Jarne P，Cornuet J M.Homoplasy and mutation model at microsatellite loci and their consequences for population genetics analysis［J］.Molecular Ecology，2002，11:1591-1604.

［18］岳根華，Kovacs B，Orban L.微衛(wèi)星跨物種交叉PCR擴(kuò)增的一個新問題:擴(kuò)增非同源產(chǎn)物［J］.動物學(xué)研究，2010，31(2):131-140.