葛 軍，丁麗娜，劉曉光

(江蘇大學生命科學研究院，鎮(zhèn)江212013)

1970年Nealson等研究一種海洋發(fā)光細菌費氏弧菌(Vibrio fischeri)時發(fā)現(xiàn)，這種在液體環(huán)境中生長的細菌只有細胞濃度達到一定數(shù)量時，才會產生發(fā)光作用［1］。細菌的生物發(fā)光與細菌的種群密度緊密相關，而這種現(xiàn)象是受到群體感應(Quorum-sensing，QS)的控制。自從發(fā)現(xiàn)了費氏弧菌LuxR/LuxI的群體感應現(xiàn)象，我們知道了細菌不是單獨的個體，它通過產生小分子的信號進行交流。當細菌量較少時，它產生的信號不能被其他細菌感知，但是隨著細菌濃度的增加，信號濃度增加，當達到一定閾值時，細菌能夠感應到周圍環(huán)境中自身或其他細菌的數(shù)量變化，并通過信號分子啟動相關基因的表達，改變和協(xié)調它們之間的行為，共同展示出它們的某些生理特性，從而表現(xiàn)出單個細菌無法從事的某些生理功能和調節(jié)機制，這種行為就是群體感應［2］。細菌群體感應可以產生不同的信號分子，調節(jié)多種功能，如影響毒力因子的產生，共生現(xiàn)象，細胞的傳播與分布，質粒的結合和轉移，生物膜的形成等，同時，QS還可以調控多種胞外酶和次生代謝物的產生，如蛋白酶、幾丁質酶、吲哚乙酸、抗生素、嗜鐵素等的生物合成［3-5］。許多革蘭氏陰性菌利用N-乙?；呓z氨酸內酯 (N-acylhomoserine lactones，AHLs)作為胞間信號分子協(xié)調細菌群體基因的表達。在革蘭氏陰性細菌中群體感應的調控機制需要兩種組分參與:LuxI蛋白與LuxR蛋白。其中LuxI蛋白是AHL合成酶，負責信號分子的合成，而LuxR蛋白是信號受體，形成受體-自體誘導物復合體，當該復合體與目的基因啟動子結合，就能激活該基因的轉錄［6-7］。

S.plymuthica菌株G3是分離自小麥內莖的植物內生細菌［8］，具有生防因子的潛能。前期研究我們已經鑒定了G3菌株中存在2個QS系統(tǒng)SplIR和SpsIR，采用AHL信號淬滅(Quorum quenching，QQ)的策略，表明QS參與全局調控多種生防表型，且正調控生物膜形成，但對泳動運動性幾乎沒有影響［8-9］。然而兩個QS系統(tǒng)SplIR和SpsIR之間的關系是相互平行、相互拮抗，還是上下游關系，還有待進一步研究。因此本研究以S.plymuthica G3菌株為模式細菌，通過基因替換、同源重組策略構建了splI和 spsI的突變體及互補菌株，并進行了表型分析和驗證。為進一步闡明QS調控網(wǎng)絡全局調控S.plymuthica生防相關表型的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 本實驗所用菌株、質粒及引物見表1。

表1 實驗中用到的菌株，質粒和引物Table 1 Strains，plasmids and primers used in this study

1.2 主要實驗試劑

pMD18T-simple等載體、各種限制性內切酶、T4 DNA連接酶等購自Takara和Fermentas。基因組DNA和質粒提取試劑盒，以及PCR產物純化試劑盒購自Axygen Biosciences Inc。氨芐青霉素(Amp)的終濃度為 100 μg/mL，慶大霉素(Gm)終濃度為 25 μg/mL，氯霉素(Cm)終濃度為25 μg/mL，利福平(Rif)終濃度為 40 μg/mL，鏈霉素(Sm)終濃度為50 μg/mL，四環(huán)素(Tc)終濃度為 25 μg/mL。

LB(Luria-Bertani broth)培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g，酵母浸膏粉5 g，氯化鈉10g，加水至1 L。101bf/in2(6.895×104Pa)高壓下蒸汽滅菌20 min，常溫儲存。LA(LB agar)培養(yǎng)基通過在LB中添加1.5%瓊脂粉固化獲得。

1.3 方法

1.3.1 splI基因的克隆

利用軟件DNAStar設計引物splIR-F和splIR-R(見表1)。G3基因組DNA的提取按試劑盒使用說明書操作，使用引物對splIR-F/R進行PCR擴增，PCR反應體系為:94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，30個循環(huán);72℃ 10 min。PCR產物純化后與pMD18T-simple連接，于16℃ 反應4 h，42℃ 熱擊轉化E.coliJM109感受態(tài)細胞。涂布于含 Amp、IPTG、X-gal的LA平板上，37℃ 過夜培養(yǎng)。挑取白色菌斑獲得pMD18T-simple-splI，并進行菌落PCR鑒定。

1.3.2 △splI、△spsI突變體的構建及篩選

挑取陽性菌落提取質粒 pMD18T-simple-splI，用SalI酶切DNA片斷，插入Gm抗性基因 (由SalI酶切質粒 p34S-Gm所得)，獲得質粒 pMD18T-simple-splIGm。再通過PCR回收得到2222bp splI-Gm的基因片段后平端化，插入經SmaI酶切的自殺性載體pDM4，獲得重組質粒pDM4-splI-Gm，轉化大腸桿菌S17-1，37℃過夜培養(yǎng)。挑選菌落進行PCR和酶切驗證。

因為G3和C48菌株的splI和spsI基因序列具有100% 同源性。本實驗直接使用賈金麗構建的C48菌株spsI突變體的自殺性質粒 S17-1/pDM4-spsI-Sm［14］。挑取陽性菌落S17-1/pDM4-splI-Gm、S17-1/pDM4-spsISm在37℃，野生菌G3在28℃搖床中200 r/min條件下過夜培養(yǎng)，經雙親配合，分別涂布于Rif、Cm、Gm與Rif、Cm、Sm抗性平板上，培養(yǎng)48 h;挑取單菌落于10%蔗糖板上劃線，進一步挑取單菌落，篩選在Cm平板上不生長，而在Gm平板上生長的克隆，表明已發(fā)生雙交換，即得到S.plymuthica G3的splI、spsI基因突變菌株。

1.3.3 △splI、△splI突變體的驗證

提取突變株△splI、△spsI的基因組DNA，以基因組DNA為模板進行PCR驗證;然后將PCR產物克隆到pMD19-T載體，挑選陽性克隆測序驗證。

1.3.4 互補菌株的構建

構建互補菌株的供體 S17-1/pUCP26-spsI、S17-1/pUCP26-splIR 也由賈金麗完成［14］。經與△spsI、△splI突變菌株雙親配合得到具有四環(huán)素抗性的△spsI、△splI的互補菌株△spsI/pUCP26-spsI、△splI/pUCP26-splIR。

1.3.5 相關表型的檢測

表型檢測包括AHL信號產生、蛋白酶活性和泳動性分析。具體方法見參考文獻［9］。

2 結果

2.1 splI、spsI突變體的構建及篩選

質粒 pMD18T-simple-splI經 SalI酶切后，插入經SalI酶切的800 bp Gm抗性基因，獲得pMD18T-simplesplI-Gm;陽性質粒平端化后與經SmaI酶切的自殺性載體pDM4連接，得到自殺性重組質粒pDM4-splI-Gm(圖1)。通過PCR驗證篩選陽性克隆。如圖2所示，用G3基因組為模板，PCR得到未插入Gm片段基因片段splI(1422bp)及spsI(733bp);分別以splI和spsI突變體基因組為模板，，PCR得到插入Gm成功后的陽性質粒片段splI-Gm(2222bp)以及spsI-Gm(2700bp)。

分別以 S17-1/pDM4-splI-Gm、S17-1/pDM4-spsI-Sm為供體菌，野生型菌株G3為受體菌，經過雙親接合轉移及同源重組，分別篩選出在Cm平板上不生長，而在Gm或Sm平板上生長的克隆，即得到S.plymuthica G3的splI、spsI基因突變菌株△splI、△splI。并通過 PCR和測序驗證。

2.2 突變對AHL信號產生的影響

利用報告菌株Chromobacterium.violaceum CV026(紫色桿菌)劃線檢測其AHL信號，48 h進行表型觀察。結果如圖3所示，splI、spsI突變菌株及空載體對照菌株釋放的信號分子相比野生型G3都減弱，但是減弱的效果不是很明顯。更精確地信號檢測需要運用液質聯(lián)用質譜tandem mass spectrometry coupled to liquid chromatography(LC-MS/MS)技術進行定量分析驗證。

圖3 splI(A)及spsI(B)對AHL信號產生的影響Fig 3 Detection AHLs of splI(A)and spsI(B)by CV026

2.3 突變對蛋白酶活性的影響

很多細菌的QS系統(tǒng)已經被報道參與調節(jié)次級代謝產物和胞外酶如蛋白酶、幾丁質酶等。通過蛋白酶活性檢測分析發(fā)現(xiàn)，△splI、△spsI突變體的蛋白酶水解圈與野生菌G3相比，蛋白酶活性明顯減少，表明SplI、SpsI作為激活子，正調控蛋白酶的產生。對△splI、△spsI互補菌株進行蛋白酶檢測，發(fā)現(xiàn)互補菌株蛋白酶活性恢復到野生型水平，但空白對照沒有明顯變化(圖4)。

圖4 splI(A)及spsI(B)對蛋白酶活性的影響Fig 4 Protease activity of splI(A)and spsI(B)

2.4 泳動性分析

Swimming motility(泳動運動)主要依靠極化鞭毛，運動性與細菌侵染力和定殖有關，這種運動可以在低瓊脂培養(yǎng)基上觀測到。在28℃培養(yǎng)12 h后，觀測G3、△splI、△spsI以及互補菌株和空白對照的運動情況，然后測出運動距離，最后利用統(tǒng)計學分析。由圖5可以看出splI突變后，與野生型相比運動效果加強，達到極顯著水平(p＜0.001)，說明splI負調控G3的運動性。而由圖6可知當spsI突變后，運動明顯減弱，與野生型相比也達到了(p＜0.001)極顯著水平，說明spsI正調控G3的運動性。

3 討論

自從在費氏弧菌中發(fā)現(xiàn)第一個群體感應(QS)調控元件以來，隨著對細胞信號傳導的深入了解，微生物作為單個細胞卻行使多細胞功能的研究成為探索的熱點。在過去的幾十年，在許多的革蘭氏陰性菌發(fā)現(xiàn)了QS。在這些細菌中QS系統(tǒng)主要調控毒力因子、運動性、結合轉移、生物膜的形成、生長抑制和次級代謝產物的合成等，次級代謝產物主要是抗生素、嗜鐵素、蛋白酶、幾丁質酶等。群體感應系統(tǒng)受AHLs信號濃度的調控，進而調節(jié)細菌中一些特定基因表達［1-4，7］。

已有的研究表明在菌株C48中SplI負責產生所有3種類型的AHL信號分子，占主導地位;SpsI產生的信號分子較少，只負責產生非取代基的AHL信號。所以當splI突變時，相比spsI突變對蛋白酶活性，生物膜的形成量和對板栗疫病菌抑制作用更明顯，同時只殘留痕量AHL信號。同時splI突變后明顯抑制硝吡咯菌素的產生［10，14］。在本實驗中，當 splI、spsI單獨突變時信號分子減弱不是很明顯，與C48菌株中以SplI為主導的情況有所不同，其分子機理還有待于進一步研究。而G3菌株splI突變后導致運動性增強;spsI突變引起運動性明顯降低表明SplI和SpsI差異調控G3菌株的泳動運動性，兩者作用相互抵消的最終結果可能導致雙突變對運動性沒有明顯影響，尚需實驗驗證。這與已報道的G3菌株AHL信號淬滅沒有明顯影響運動性［9］的結果并不沖突。

總之，目前對于S.plymuthica G3中SplI/SplR和SpsR/SpsI QS系統(tǒng)的了解還很少。本實驗為繼續(xù)構建splI和spsI雙突變，以及通過報告基因融合分析等進一步研究QS網(wǎng)絡中基因的功能和相互作用機制奠定基礎。

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