黃有凱，曹丹琴，彭媛媛，龔凌燕，張水明

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，合肥230036;2.合肥一中，合肥230036)

石榴(Punica granatum L.)為石榴科石榴屬多年生落葉果樹，又名安石榴、若榴。石榴色澤艷麗，外形美觀，籽粒晶瑩，味美多汁，富含營養(yǎng)，很受歡迎。因其具有較高的經(jīng)濟(jì)價值，近年來，中國學(xué)者已針對石榴進(jìn)行了品種改良和選育等工作。

分子生物學(xué)中，高質(zhì)量 RNA的提取是進(jìn)行cDNA文庫建立、Northern雜交、基因克隆及差異表達(dá)分析等分子生物學(xué)實驗的基礎(chǔ)［1］。常用的提取植物 RNA的方法有很多，如 SDS-酸酚法，異硫氰酸胍法，CTAB法、Trizol reagent kit法等，這些方法均能提取出石榴籽粒RNA，但效果欠佳且異硫氰酸胍和 Trizol試劑比較昂貴。針對石榴籽粒中含有蛋白質(zhì)、多糖、酯類等物質(zhì)的干擾，對比各種提取方法特點和效果，本著經(jīng)濟(jì)，簡便且高效的原則，本研究在原有的 CTAB法基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，成功獲得了高質(zhì)量的總RNA。在此基礎(chǔ)上通過反轉(zhuǎn)錄、PCR試驗成功擴(kuò)增了預(yù)期大小的Actin基因片段，此方法得到的石榴籽?？?RNA可滿足 cDNA、RT-PCR等分子生物學(xué)研究，為石榴的分子生物學(xué)研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從懷遠(yuǎn)采集的“紅玉石籽”石榴品種，剝?nèi)∈褡蚜Ｈ舾?，用液氮速凍后置?80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 石榴籽?？俁NA的提取

針對石榴籽粒富含多糖、酚類、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的干擾，在一般 CTAB法［2-4］的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，具體操作步驟如下:

取4支2 mL離心管，分別加入1 mL 2%CTAB抽提液，65℃水浴預(yù)熱10 min;取適量紅玉石籽石榴籽粒，加入液氮研磨至粉末狀，迅速均勻轉(zhuǎn)入離心管中，充分混勻，65℃水浴30 min，每5 min搖晃1次;4℃下12000 r/min離心10 min;取上清液于新的2 mL離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1)抽提，上下顛倒混勻，4℃下12000 r/min離心10 min，反復(fù)抽提兩次;取離心后的上清液于新的2 mL離心管中，加入1 mL無水乙醇，離心收集沉淀，用 DEPC處理水溶解，攪拌，根據(jù)溶液體積加入 1/4體積10 mol/L LiCl使LiCl終濃度為2 mol/L，-20℃下過夜析出沉淀;4℃，12000 r/min離心10 min，收集沉淀，用70% 乙醇清洗沉淀后用 DEPC處理過的 20 μL水溶解，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA質(zhì)量檢測

取5 μL RNA產(chǎn)物進(jìn)行1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外透射儀下觀察RNA條帶，分析總RNA的完整性;另取5 μL RNA產(chǎn)物利用 DU-800紫外分光光度計測其260 nm和280 nm的 OD值，計算 OD260/OD280。

1.2.3 RT-PCR檢測

以 1 μg總 RNA為模板，按照 TaKaRa公司的M-MLV RNase cDNA Synthesis Kit說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，將產(chǎn)物稀釋20倍作為 PCR反應(yīng)的模板。PCR反應(yīng)所用引物來源于 Genbank上已知的Actin基因序列［5］，引物序列為上游引物 ActinF:5'CAATGTGCCTGCCATGTATG3'，下游引物 ActinR:5'CCAGCAGCTTCCATTCC AAT3'。PCR反應(yīng)體系為模板 1 μL、Taq DNA 酶 0.25 μL、Actin 上下游引物 各 1 μL、dNTP 1 μL、Mg2+2.5 μL、10 × buffer 2.5 μL，加 ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min;94℃ 30 s;58℃ 35 s;72℃ 90 s，共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外透射儀下觀察并照相記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量分析

石榴籽?？俁NA的質(zhì)量對后續(xù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的影響較大，純度高和完整性好的RNA的28S和18S條帶清晰明亮，28S條帶熒光亮度是18S條帶的1.5～2.0倍，且 RNA的 OD260nm/OD280nm應(yīng)介于 1.8～2.0之間［6］。凝膠電泳是檢驗 RNA質(zhì)量的一種重要手段，從電泳圖上不僅可以判斷出RNA的完整性和降解度，也可以判斷出是否有 DNA、蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)的污染［7］。以石榴籽粒為材料提取總 RNA，1.0% 凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，28S、18S兩條條帶清晰且28S rRNA的亮度約為18S rRNA的2倍，背景較干凈(圖1)，表明該試驗提取的RNA完整性較好。用DU-800紫外分光光度計測得的 OD260nm/OD280nm為 1.9960，介于1.8～2.0之間，純度較高。表明用改良 CTAB法提取出的石榴籽?；緵]有蛋白質(zhì)和DNA的污染，可用于后續(xù)分子生物學(xué)試驗。

圖1 改良CTAB法提取石榴籽?？俁NA電泳結(jié)果Fig 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA with modified CTAB method

2.2 RT-PCR結(jié)果分析

由于反轉(zhuǎn)錄對 RNA純度要求很高，高質(zhì)量的RNA對于全長 cDNA文庫的構(gòu)建非常重要。為了進(jìn)一步檢測石榴籽?？俁NA的質(zhì)量，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA第一鏈，以其為模板，ActinF和ActinR為上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期片段大小為500 bp左右，結(jié)果顯示在500 bp附近有一條亮帶(圖2)，符合預(yù)期目的片段大小，條帶清晰，背景干擾小，說明反轉(zhuǎn)錄成功，所提取的RNA完整性好，純度較高，可以進(jìn)行后續(xù)RT-PCR等分子生物學(xué)試驗的研究。

圖2 石榴籽粒Actin基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig 2 PCR product of Actin from seeds of pomegranate

3 討論

通過上述改良CTAB法對石榴籽?？?RNA進(jìn)行提取并檢測獲得了質(zhì)量較高的RNA。石榴籽粒中含有多糖、蛋白質(zhì)、酯類等物質(zhì)的干擾，多糖與RNA的理化性質(zhì)相似，抽提過程中容易與RNA形成難溶的膠狀物沉淀［8，9］，以致 RNA 產(chǎn)率低、純度不高，在改良CTAB法中，經(jīng)過兩次氯仿/異戊醇抽提，再加入少量無水乙醇沉淀，有效地去除了多糖、蛋白質(zhì)類物質(zhì)影響［10］，抽提過程中用氯仿而不用苯酚，既可除去蛋白質(zhì)又避免了苯酚對mRNA的破壞。2 mol/L LiCl過夜沉淀可以去除 DNA污染并減少 RNA的降解幾率，LiCl本身沉淀大RNA效果好的特點使得到的RNA大片段損失很少，更適合用于后續(xù)的分子生物學(xué)實驗，同時LiCl也可以使部分多糖留在溶液中而不隨RNA沉淀下來［11］。試驗中也嘗試采用 Trizol reagent kit法、異硫氰酸胍法、一般CTAB法等方法提取 RNA，但 Trizol法提取的RNA產(chǎn)量過低且Trizol試劑價格昂貴，異硫氰酸胍法未能有效去除多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，一般CTAB法提取的 RNA中 DNA污染嚴(yán)重［12］，而改良CTAB法能較簡單、經(jīng)濟(jì)、高效地解決石榴籽?？?RNA提取中所遇到的問題。

Actin是一種廣泛參與真核細(xì)胞生理過程的重要基因，在基因表達(dá)調(diào)控研究時被廣泛用作分子內(nèi)標(biāo)［13，14］，內(nèi)標(biāo)基因一般是在不同的處理條件下表達(dá)相對穩(wěn)定的管家基因。肌動蛋白(Actin)普遍存在于真核細(xì)胞中，該基因的表達(dá)具有穩(wěn)定性，在物種內(nèi)各組織中保持相對恒定的表達(dá)水平，常在定量、半定量 RTPCR、Northern雜交實驗中被用作內(nèi)參基因校正樣本量［15］。為進(jìn)一步驗證提取的石榴籽?？俁NA能否用于后續(xù)分子生物學(xué)實驗，以 Actin基因為鑒定的對象，通過RT-PCR進(jìn)行驗證，得到一條單一的Actin基因片段，且條帶大小符合預(yù)期片段大小，表明獲得的 RNA較好，可用于后續(xù)分子生物學(xué)分析。

本試驗采用改良 CTAB法所提取到的“紅玉石籽”石榴籽?？俁NA經(jīng)檢測完整性較好，純度較高，該方法對富含多糖、蛋白質(zhì)、酯類等次生代謝物的植物材料總RNA的提取具有借鑒意義。

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