陳久艷，方敏，吳再珍，楊宏，周群剛，#，謝洪平#（.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇蘇州252；2.蘇州市立醫(yī)院，江蘇蘇州 25002；.蘇州市中心血站，江蘇蘇州 25006）

復(fù)方鹽酸阿米洛利片為鹽酸阿米洛利及氫氯噻嗪的復(fù)方制劑，主要用于心力衰竭、肝硬化等引起的水腫及腹水與高血壓病等的治療。復(fù)方鹽酸阿米洛利片的含量測(cè)定在2010年版《中國(guó)藥典》中是采用高效液相色譜（HPLC）法[1]，文獻(xiàn)[2-4]也有采用HPLC法和紫外光譜法的報(bào)道。本文基于多元校正的偏最小二乘（PLS）法[5]，利用近紅外光譜技術(shù)，在樣本不經(jīng)任何預(yù)處理的條件下，建立了一種將該復(fù)方制劑中兩組分快速、同時(shí)測(cè)定的方法，實(shí)現(xiàn)了復(fù)方鹽酸阿米洛利片的快速質(zhì)量評(píng)價(jià)，具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

1 材料

傅立葉變換NEXU紅外光譜儀，配有積分球漫反射采樣系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Electron公司）。

鹽酸阿米洛利原料藥（批號(hào)：11103001，純度：100.3%）、氫氯噻嗪原料藥（批號(hào)：11101002，純度：98.7%）均來自江蘇迪賽諾制藥有限公司；復(fù)方鹽酸阿米洛利片（某廠提供，批號(hào)：110801、110701、111101，規(guī)格：每片含鹽酸阿米洛利2.5 mg、氫氯噻嗪25 mg）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣本制備與近紅外光譜測(cè)定

以處方為依據(jù)，將輔料與兩組分（原料藥）進(jìn)行混合，制備成41個(gè)混合樣本，在每個(gè)樣本中兩組分的含量均不同，鹽酸阿米洛利為1.5840%～2.5682%、氫氯噻嗪17.1223%～23.8857%（以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)）。上述含量范圍為占標(biāo)示量百分含量的80%～120%，包含了該制劑的法定含量范圍（即占標(biāo)示量百分含量的90%～110%）。分別將上述粉末混合樣本直接裝入普通的青霉素玻璃瓶中，充分振搖均勻，并在實(shí)驗(yàn)臺(tái)面反復(fù)振動(dòng)使其盡可能緊密堆積，同時(shí)檢測(cè)近紅外光譜，若前后2次檢測(cè)的光譜相關(guān)系數(shù)為1.0000時(shí)，即得待測(cè)樣本。

利用積分球漫反射技術(shù)測(cè)定待測(cè)樣本的近紅外光譜，以3次測(cè)定的平均光譜作為樣本的光譜。光譜采集條件：掃描次數(shù)32次、分辨率8 cm－1、光譜范圍10000～4000 cm－1、以聚四氟乙烯為光譜掃描背景材料。

2.2 光譜預(yù)處理

分別測(cè)定41個(gè)混合樣本的近紅外光譜，原始光譜見圖1A。

圖1 41個(gè)樣本近紅外光譜Fig 1 NIR spectrums of 41 samples

從圖1A中無信息光譜區(qū)間9000～10000 cm－1處可見該樣本光譜明顯發(fā)生了漂移，用基線校正的方法對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理，可有效地消除基線漂移，使光譜的變化僅反映樣本組成和含量的變化，見圖1B。

2.3 建立鹽酸阿米洛利、氫氯噻嗪的PLS法定量分析多元校正模型

在41個(gè)混合樣本中，以樣本組分含量均勻分布為原則，用29個(gè)樣本構(gòu)建校正集，其余樣本構(gòu)建預(yù)測(cè)集。以“剔一”交互檢驗(yàn)法確定最佳主因子數(shù)，得鹽酸阿米洛利和氫氯噻嗪的定量分析多元校正模型的最佳主成分?jǐn)?shù)均為9。以29個(gè)混合樣本的近紅外量測(cè)光譜在9000～4000 cm－1范圍內(nèi)的吸光度為變量，利用PLS法在鹽酸阿米洛利含量與多個(gè)吸光度之間建立校正模型，見圖2A；同法建立氫氯噻嗪的校正模型，見圖2B。

圖2 實(shí)際含量與預(yù)測(cè)含量關(guān)系曲線Fig 2 Relationship curves of actual contents and predicated ones

以樣本量測(cè)光譜的吸光度為變量，利用所建立的組分的校正模型，計(jì)算該樣本中組分的含量。對(duì)于被測(cè)樣本，據(jù)此即可實(shí)現(xiàn)組分的含量測(cè)定。對(duì)于建立模型的29個(gè)校正集樣本，根據(jù)模型計(jì)算獲得的含量與樣本中的實(shí)際含量，即可計(jì)算獲得他們之間的相關(guān)系數(shù)和均方根殘差。計(jì)算得鹽酸阿米洛利和氫氯噻嗪的相關(guān)系數(shù)均為0.9962，均方根殘差分別為0.0252、0.1735。表明2個(gè)模型具有較為理想的擬合能力，能夠良好地反映實(shí)際樣本中含量的統(tǒng)計(jì)行為。而對(duì)于另外的12個(gè)預(yù)測(cè)集樣本，鹽酸阿米洛利和氫氯噻嗪的相關(guān)系數(shù)分別為0.9902、0.9903，均方根殘差分別為0.0516、0.3548。從上述參數(shù)可知，所建立的2個(gè)模型具有良好的預(yù)測(cè)能力。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一待測(cè)樣本重復(fù)測(cè)定6次，分別用建立的校正模型計(jì)算鹽酸阿米洛利和氫氯噻嗪的含量。結(jié)果，鹽酸阿米洛利、氫氯噻嗪的RSD分別為1.2230%、0.9916%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一待測(cè)樣本連續(xù)測(cè)定5 d，分別用校正模型計(jì)算鹽酸阿米洛利和氫氯噻嗪的含量。結(jié)果，鹽酸阿米洛利、氫氯噻嗪的RSD分別為0.7196%、0.3698%，表明樣本穩(wěn)定性良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

分別取高、中、低水平的3個(gè)樣本，每個(gè)樣本按“2.1”項(xiàng)下方法重復(fù)測(cè)定3次，分別用校正模型計(jì)算鹽酸阿米洛利和氫氯噻嗪的含量。以實(shí)際含量為基礎(chǔ)，計(jì)算該復(fù)方制劑中兩組分的回收率，結(jié)果見表1（表中含量與回收率的“%”為質(zhì)量百分比）。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of recovery tests of samples（n＝3）

從表1的回收率和相應(yīng)的RSD結(jié)果可知，本方法有良好的準(zhǔn)確度。

2.7 含量測(cè)定

取某廠的3批次樣本，分別測(cè)定光譜，用建立的校正模型分別計(jì)算鹽酸阿米洛利和氫氯噻嗪的含量。結(jié)果3批樣本中鹽酸阿米洛利占標(biāo)示量的百分含量分別為104.14%、104.27%和103.53%，氫氯噻嗪分別為97.40%、97.28%和97.78%。

另按2010年版《中國(guó)藥典》復(fù)方鹽酸阿米洛利片“含量測(cè)定”項(xiàng)下[1]的HPLC法，分別測(cè)定3個(gè)批次樣本鹽酸阿米洛利和氫氯噻嗪的含量，相應(yīng)結(jié)果分別為：鹽酸阿米洛利102.58%、102.01%和100.62%，氫氯噻嗪94.84%、96.04%和95.56%。與本方法的測(cè)定結(jié)果比較，兩者之間存在1.24%～2.91%的偏差，從一般性原則分析，這樣的方法學(xué)偏差范圍是合理的。

3 討論

3.1 粉末樣本混合均勻程度與堆積緊密程度

在樣本的制備過程中，每個(gè)樣本中組分的混合均勻性以及樣本間堆積緊密程度的一致性是保證測(cè)定準(zhǔn)確性的主要因素。按41個(gè)樣本設(shè)計(jì)的要求，分別將2個(gè)待測(cè)組分和輔料置于青霉素玻璃瓶中，在充分倒置混合后，不斷振動(dòng)使其粉末盡可能堆積緊密，并測(cè)定近紅外漫反射光譜。若經(jīng)2～3次重復(fù)操作后，樣本光譜重疊，且光譜相關(guān)系數(shù)為1.0000時(shí)，認(rèn)為此時(shí)樣本達(dá)到了混合均勻和盡可能緊密的程度，將此時(shí)的樣本作為待測(cè)樣本。

3.2 青霉素玻璃瓶對(duì)樣本光譜的影響

為了考察樣品瓶的不均勻性對(duì)樣本光譜的影響，對(duì)于同一樣本先后采用不同的樣品瓶按“2.1”項(xiàng)下方法混合并測(cè)定其光譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同樣品瓶中的同一樣本光譜能夠達(dá)到完全重疊，光譜相關(guān)系數(shù)為1.0000。由此可見，青霉素玻璃瓶之間的差異性對(duì)研究體系準(zhǔn)確度不構(gòu)成影響，可以將樣本粉末直接裝入此類瓶中測(cè)定。

3.3 近紅外光譜快速分析與藥典HPLC方法的比較

對(duì)于本文建立的復(fù)方鹽酸阿米洛利片近紅外光譜快速分析方法，從上述的方法學(xué)考察能夠充分地說明該方法可準(zhǔn)確測(cè)定兩組分的含量。本方法的回收率（96.70%～106.06%）能夠滿足藥品含量測(cè)定指導(dǎo)性原則對(duì)“回收率的一般要求”，即90%～110%。當(dāng)然上述要求是對(duì)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)的一般要求。而近紅外光譜藥物分析方法在現(xiàn)階段是不適宜作為“國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)”方法，而適宜于生產(chǎn)過程和藥房貯藏過程中對(duì)藥品質(zhì)量的常規(guī)檢控，其顯著特點(diǎn)是快速性和非破壞性。

為了進(jìn)一步說明本文所建立方法的可靠性，按《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)的HPLC法對(duì)3個(gè)批次樣本進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果兩者之間存在1.24%～2.91%的偏差。雖然這種偏差的數(shù)值不大，但是其所表現(xiàn)的是“HPLC法的結(jié)果較近紅外光譜偏小1.24%～2.91%”，這可能是由于2種方法的固有性質(zhì)所決定的。HPLC法是在組分分離基礎(chǔ)之上的分析方法，表現(xiàn)出高度的專屬性；而近紅外光譜分析是在所有干擾組分共存條件下，利用多元校正分析建立多波長(zhǎng)定量模型的分析方法，是由多波長(zhǎng)下的多變量檢測(cè)信號(hào)的組合而實(shí)現(xiàn)方法的專屬性。上述偏小的結(jié)果預(yù)示著后者的專屬性略微弱于前者，也正是由此決定了近紅外光譜分析主要適用于藥物的非破壞性快速分析，而不適宜作為國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)分析。

基于PLS法，筆者利用近紅外漫反射光譜分析技術(shù)建立了復(fù)方鹽酸阿米洛利片中鹽酸阿米洛利和氫氯噻嗪這2種有效成分含量的快速、簡(jiǎn)單、不經(jīng)任何樣本預(yù)處理過程的測(cè)定方法，實(shí)現(xiàn)了該復(fù)方片劑含量的直接測(cè)定。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確可靠，模型具有較強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力、良好的穩(wěn)定性和適應(yīng)性，可用于該制劑質(zhì)量的快速評(píng)價(jià)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：586-587.

[2]費(fèi)培根，楊水新.高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方鹽酸阿米洛利片的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24（1）：33.

[3]王鋒，王偉佳.高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方鹽酸阿米洛利血藥濃度[J].今日藥學(xué)，2011，21（2）：81.

[4]吳軍，李新霞，陳堅(jiān).光纖藥物在位溶出度/釋放度監(jiān)測(cè)儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)復(fù)方鹽酸阿米洛利片體外溶出度[J].藥物分析雜志，2007，27（2）：238.

[5]梁逸曾，俞汝勤.化學(xué)計(jì)量學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2003：125-127.