劉立明

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林 132101）

傳統(tǒng)的基因疫苗載體主要為病毒載體，其轉(zhuǎn)移率較高，穩(wěn)定性強(qiáng)，但是靶向性不強(qiáng)，存在安全風(fēng)險(xiǎn)、容量限制以及局部用藥極不方便等問題。理想的腫瘤治療基因載體應(yīng)具有良好的靶向性，減毒沙門氏菌就具有良好的嗜腫瘤特性。沙門氏菌（salmonella）是一種胞內(nèi)寄生的兼性厭氧菌，突破腸道屏障的沙門氏菌被吞噬細(xì)胞吞噬后，被運(yùn)送至相關(guān)粘膜及全身淋巴組織，通過血液循環(huán)，定居在肝、脾及腫瘤組織。本研究以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因?yàn)槟康幕驑?gòu)建真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門氏菌，在體外對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究，為進(jìn)行各種目的基因的導(dǎo)入研究其在腫瘤基因治療中的作用，為進(jìn)一步闡明其靶向性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

脂質(zhì)體 Lipofectamine，PVAX-EGFP質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存，Xho I與BamH I購(gòu)自 Invitrogen公司，RPMI 1640 培養(yǎng)液、牛血清購(gòu)自Gibco 公司，人肝癌細(xì)胞HepG-2購(gòu)自中科院上海生命研究院。熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)為日本Olymps產(chǎn)品。

1.2 PVAX-EGFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化Ty21

無菌操作取1.5μL（5pg-0.5μg）PVAX-EGFP質(zhì)粒加入到裝有新鮮制備的沙門氏菌感受態(tài)細(xì)胞的小管中混勻；將混合物轉(zhuǎn)移至電極杯中，放入樣品槽；將電轉(zhuǎn)儀電壓調(diào)到1.5kV，電擊后取出電極杯，立刻加入1 ml LB培養(yǎng)液，混勻轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)管中，37℃中振蕩培養(yǎng)40min，涂布于含有AmpLB平板上。

1.3 重組沙門氏菌中質(zhì)粒的鑒定

挑去單菌落接種于含有Amp的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，從沙門氏菌中抽提質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，抽提的質(zhì)粒進(jìn)行Xho I與BamH I雙酶切，將鑒定含有PVAX-EGFP的沙門氏菌命名為Ty21/PVAX-EGFP。

1.4 含PVAX-EGFP沙門氏菌轉(zhuǎn)染HepG-2細(xì)胞

在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種1×105個(gè)HepG-2細(xì)胞，營(yíng)養(yǎng)液為1640（含5%胎牛血清），5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)18～24 h至40～60%的細(xì)胞融合度，轉(zhuǎn)染前，用0.01 mol/L PBS（pH7.4）洗滌細(xì)胞1次；5 000 rpm離心收集菌體，用0.01 mol/L PBS 重懸；用Ty21/PVAX-EGFP 重組菌感染細(xì)胞（數(shù)量為10∶1）20 min；用0.01 mol/L PBS（pH7.4）洗滌細(xì)胞3 次，再用含100 mg/L 青鏈霉素的1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h；換用含10 mg/L 青鏈霉素的1640（含2 %胎牛血清）繼續(xù)培養(yǎng)48～96 h，在熒光倒置顯微鏡下觀察EGFP在細(xì)胞的表達(dá)。

1.5 Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞中EGFP

收集轉(zhuǎn)染時(shí)間為72 h 的HepG-2細(xì)胞，用胰酶消化，反復(fù)凍融5 次，4℃，8 000 r/min 離心5 min，收集上清液，加入等量上樣緩沖液，煮沸5 min，冰浴2 min，- 20℃?zhèn)溆?。?xì)胞裂解物經(jīng)SDSPAGE 電泳分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜，用5 %脫脂奶PBS 封閉液封閉2 h，用0.5 %吐溫-20 的PBST洗滌3 次（每次10 min），加入適量用封閉液稀釋的鼠抗EGFP血清，37℃作用1.5 h后，再用PBST洗滌3 次（10 min/次），加入作適當(dāng)稀釋的羊抗鼠IgG-HRP 1 h，用PBST 洗膜3次（10 min/次）后，顯色。

2 結(jié)果

2.1 沙門氏菌中重組質(zhì)粒的鑒定

質(zhì)粒進(jìn)行Xho I與BamH I雙酶切后，出現(xiàn)約780bp的目的條帶，詳見圖1：

圖1 沙門氏菌重組質(zhì)料圖譜

2.2 熒光檢測(cè)

培養(yǎng)48～96 h，在熒光倒置顯微鏡下可見EGFP在細(xì)胞中表達(dá)，詳見圖2。

圖2 沙門氏菌熒光圖譜

2.3 EGFP基因在細(xì)胞中的表達(dá)

經(jīng)western blot 鑒定后在27ku處有1條特異的印跡帶，詳見圖3。

圖3 沙門氏菌印跡帶

3 討論

沙門氏菌是是1種侵襲性胞內(nèi)菌，它與宿主之間的反應(yīng)通過Ⅲ型分泌機(jī)制介導(dǎo)，這種機(jī)制使細(xì)菌的效應(yīng)蛋白能直接轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞發(fā)揮作用，使其可以傳遞表達(dá)效應(yīng)基因并同時(shí)表達(dá)多種治療性蛋白，為沙門氏菌用作腫瘤基因治療的靶向載體提供了可能。而近年來迅速發(fā)展的基因工程技術(shù)能將沙門氏菌的致病基因敲除后得到減毒菌株，為安全性提供了保證。國(guó)外將減毒鼠傷寒沙門氏菌獨(dú)立或作為基因載體治療小鼠黑色素瘤等惡性腫瘤多有報(bào)道，效果良好。國(guó)內(nèi)亦有人將減毒鼠傷寒沙門氏菌（SL3261）作為口服基因治療載體治療小鼠乳腺癌和肺癌，取得一定效果。

本研究將PVAX-EGFP利用電轉(zhuǎn)化方式成功轉(zhuǎn)入沙門氏菌中，經(jīng)熒光倒置顯微鏡觀察、western blot鑒定，證實(shí)了以減毒沙門氏菌為載體傳遞PVAX-EGFP能夠在HepG-2細(xì)胞內(nèi)得到表達(dá)，為以減毒沙門氏菌Ty21做為運(yùn)轉(zhuǎn)載體構(gòu)建新型抗腫瘤疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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