孫翠明，聞穎

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染科，沈陽(yáng) 110001）

在全世界范圍內(nèi)約50%～80%的丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染者發(fā)展為慢性肝炎、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌［1］。干擾素（interferon，IFN）或干擾素聯(lián)合利巴韋林是目前全世界公認(rèn)的治療丙型肝炎的有效措施。與IFN療效有關(guān)的因素包括病毒因素（病毒載量、病毒基因型等）［2～4］及宿主因素（年齡、性別、種族、肝臟組織學(xué)等）［5］。IFN的活性與其受體的結(jié)合力有關(guān)。干擾素受體分為Ⅰ型及Ⅱ型，Ⅰ型受體是IFN?α及IFN?β的共用受體，分為IFN?α受體1（interferon alpha receptor 1，IFNAR1）和IFN?α/β受體 2（interferon alpha/beta receptor 2，IFNAR2）［6］。有研究表明，中國(guó)漢族人群中IFNAR2與IFN治療乙型肝炎的療效有關(guān)［7］；也有一些研究表明，在丙型病肝炎患者肝組織中，IFNAR的表達(dá)與IFN抗病毒療效有關(guān)［8］。

外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）是丙型肝炎病毒的主要感染部位，但有關(guān)外周血單核細(xì)胞中IFNAR表達(dá)的研究卻很少。Yamaguchi等［9］研究表明PBMC IFNAR2 mRNA的表達(dá)水平與其在肝組織中表達(dá)水平有關(guān)，但I(xiàn)FNAR1 mRNA在外周血單核細(xì)胞及肝組織中的表達(dá)卻無(wú)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究在HCV不同感染階段PBMC IF?NAR2 mRNA的表達(dá)水平，并進(jìn)一步探討PBMC IF?NAR2 mRNA水平與IFN抗病毒療效間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

選取傳染病院肝病內(nèi)科2005年11月至2006年12月間58例未接受過IFN治療，且HCV?RNA≥1.0×103拷貝/mL的丙型肝炎患者作為實(shí)驗(yàn)組。診斷符合2000?09中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的病毒性肝炎防治方案［10］。其中54例患者丙肝抗體陽(yáng)性時(shí)間＆gt;6個(gè)月（其中8名為肝硬化），4例患者丙肝抗體陽(yáng)性時(shí)間＆lt;6個(gè)月。以下情況的患者不能入組：失代償期肝硬化；HBsAg陽(yáng)性；合并HIV感染；中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)＆lt;1 500/mm3；血小板＆lt;80 000/mm3；血紅蛋白＆lt;110 g/L；血肌酐＆gt;1.5 mg/dL；嗜酒或有藥癮者；孕婦或哺乳期婦女。入組的患者均無(wú)其他肝臟疾病。所有患者均檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、丙肝抗體、PBMC IFNAR2 mRNA水平及肝臟超聲。

按照干擾素治療前后，將實(shí)驗(yàn)分為2個(gè)階段。第一階段實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組患者分為3組：急性肝炎組（4例）；慢性肝炎組（46例）；肝硬化組（8例；Child A級(jí)，肝功能基本正常，無(wú)肝功能失代償表現(xiàn)）。15名健康志愿者作為對(duì)照組，檢測(cè)其ALT水平、HCV?RNA載量。為了去除基因型的影響，在第二階段實(shí)驗(yàn)中（IFN或IFN聯(lián)合利巴韋林治療階段：重組人干擾素α?2b 300 MU隔日皮下注射，利巴韋林1 000 mg/d口服）僅32例基因1型患者入組。所有實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)患者同意并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 PBMC的提?。簯?yīng)用密度梯度離心法，從4 mL肝素抗凝外周血中提取單核細(xì)胞。用生理鹽水稀釋外周血至8 mL，分裝至2個(gè)EP管，各加入2 mL淋巴細(xì)胞分離液后以900 g離心。室溫孵育30 min后，外周血單核細(xì)胞便處于中間層。吸取中間層細(xì)胞，于離心管中稀釋至10 mL，離心2次，并在每次離心后室溫孵育10 min。移除上清后，將外周血單核細(xì)胞于-70℃保存。

1.2.2 IFNAR2 mRNA的擴(kuò)增：用guanidineisothiocy?anate?phenol?chloroform法從外周血單核細(xì)胞中提取RNA。主要過程為：95℃預(yù)變性5 min，37℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃變性35 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃末延伸7 min。GAPDH mRNA作為內(nèi)參。IFNAR2 mRNA的擴(kuò)增引物為：上游引物5′?GCTTTTGAGCCAGAATGCCT?3′；下游引物 5′?CCCTCTGACTGTTCTTCAATG?3′。期望的產(chǎn)物大小為525 bp。GAPDH mRNA的擴(kuò)增產(chǎn)物為：上游引物5′?ATTCAAGGCACCGTCAAGG?3′；下游引物5′?GGGCCATCGATAGTCTTCTG?3′。期望產(chǎn)物大小為408 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%凝膠電泳分離。302 nm紫外線下觀察分離產(chǎn)物。IFNAR2 mRNA表達(dá)=IF?NAR2 mRNA光密度/GAPDH mRNA光密度。

1.2.3 PBMC HCV?RNA、血清 HCV?RNA 載量及HCV基因型的測(cè)定：應(yīng)用線狀基因熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增儀測(cè)定血清HCV?RNA載量（Bioer技術(shù)公司）；應(yīng)用巢式RT?PCR試劑盒測(cè)定PBMC HCV?RNA（華美技術(shù)公司）；應(yīng)用拜耳丙肝病毒試劑盒及拜耳Lipa分析法測(cè)定病毒基因型。

1.2.4 療效評(píng)價(jià)：在治療24周后，HCV?RNA仍陽(yáng)性者視為無(wú)反應(yīng)（non?response，NR）；治療12周后HCV?RNA檢測(cè)不出（＆lt;50 IU/mL）則視為完全應(yīng)答（com?plete response，CR）；治療24周后，HCV?RNA檢測(cè)不出（＆lt;50 IU/mL）則視為部分應(yīng)答（partial response，PR）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.0進(jìn)行分析。組間IFNAR2 mRNA檢出率比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。各項(xiàng)指標(biāo)間的關(guān)系應(yīng)用Pearson′s相關(guān)分析。P＆lt;0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

入組患者中沒有孕婦及兒童，男41例，女17例，平均年齡為（43±15.7）歲。急性肝炎組4例患者均為基因2型；慢性肝炎組中14例為基因2型，32例為基因1型；肝硬化組8例患者均為基因1型。在實(shí)驗(yàn)第二階段，32例基因1型患者中，28例患者完成了6個(gè)月的抗病毒療程，其中CR 12例，PR 8例，NR 8例。CR、PR及NR患者的ALT水平及體重指數(shù)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＆gt;0.05）。

2.2 PBMC IFNAR2 mRNA的表達(dá)

丙型肝炎患者PBMC IFNAR2 mRNA的檢出率為 87.9%（51/58），高于對(duì)照組（33.3%，5/15；P＆lt;0.05）。丙型肝炎患者中，男女PBMC IFNAR2mRNA的檢出率及表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［90.2%（37/41）和82.4%（14/17），P＆gt;0.05；0.743 5±0.359 7和0.677 1±0.348 0，P＆gt;0.05］。HCV不同感染階段PBMC IFNAR2 mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，急性肝炎組表達(dá)水平最高，為1.067 9±0.386 5；慢性肝炎組和肝硬化組PBMC IFNAR2 mRNA表達(dá)分別為0.746 5±0.298 2、0.422 5±0.450 3，3組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05），見圖1。

圖1 丙型肝炎患者PBMC IFNAR2 mRNA表達(dá)水平Fig.1 PBMC IFNAR2 mRNA expression of HCV patients

2.3 PBMC IFNAR2 mRNA水平與病毒載量的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)中，丙型肝炎患者PBMC HCV?RNA陽(yáng)性率為74.14%（43/58）。PBMC IFNAR2 mRNA水平在PBMCs HCV?RNA陽(yáng)性者與陰性者間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（0.699 9±0.345 9和 0.793 0±0.380 9，P=0.598）。PBMC IFNAR2 mRNA水平與治療前血清中HCV?RNA載量無(wú)關(guān)（r=0.043，P＆gt;0.05）。PBMC HCV?RNA陽(yáng)性與陰性者治療前血清HCV?RNA載量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［（2.55±3.48）×106和（1.40±1.64）×106，P=0.252］。

2.4 PBMC IFNAR2 mRNA與PBMC HCV?RNA載量、血清HCV?RNA載量及IFN療效間的關(guān)系

46例慢性丙型肝炎患者中，28例患者完成了6個(gè)月的IFN抗病毒治療。CR患者與PR、NR患者比較，PBMC IFNAR2 mRNA表達(dá)水平最高（分別為1.052 1±0.225 6和0.906 2±0.1603、0.483 8±0.202 7，P＆lt;0.05），而PR患者高于NR患者（0.906 2±0.160 3和0.483 8±0.202 7，P＆lt;0.05）。CR組、PR組與NR組間PBMC及血清HCV?RNA載量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［分別為（1.81±2.93）×106、（2.78±3.45）×106、（2.44±3.44）×106，P＆gt;0.05］。

3 討論

Ren等［11］報(bào)道，HCV感染可上調(diào)IFNAR2 mRNA在肝臟中的表達(dá)。這種上調(diào)可以解釋為機(jī)體對(duì)病毒感染的一種反應(yīng)，參與機(jī)體清除病毒的免疫應(yīng)答：機(jī)體通過上調(diào)IFNAR2 mRNA表達(dá)來(lái)提高與內(nèi)源性或外源性IFN的結(jié)合，從而加強(qiáng)對(duì)病毒的清除。本實(shí)驗(yàn)中，58例丙型肝炎患者PBMC IFNAR2 mRNA的檢出率與表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HCV毒感染不同階段PBMC IFNAR2 mRNA的表達(dá)水平不同。急性肝炎組患者檢出率為100%。Ohata等［12］的實(shí)驗(yàn)顯示急性肝炎患者PBMC IFNAR2 mRNA的表達(dá)水平高于慢性肝炎組。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)顯示慢性丙型肝炎患者PBMC IF?NAR2 mRNA的表達(dá)水平高于丙肝肝硬化患者，這表明隨著疾病的進(jìn)展，PBMC IFNAR2 mRNA的表達(dá)逐漸下降。Lee等［13］報(bào)道，隨著肝臟纖維化程度的進(jìn)展，肝組織中IFNAR2 mRNA的表達(dá)逐漸下降。因此更強(qiáng)調(diào)了早期抗病毒治療的重要性。

為了明確PBMC IFNAR2 mRNA表達(dá)水平與抗病毒療效的關(guān)系，本研究中28例患者應(yīng)用IFN抗病毒治療。結(jié)果表明，CR組及PR組患者PBMC IF?NAR2 mRNA表達(dá)水平顯著高于NR組。因此，認(rèn)為IFN抗病毒療效與PBMC IFNAR2 mRNA表達(dá)水平相關(guān)。HCV基因型、治療前血清及PBMC中HCV?RNA載量是目前公認(rèn)的可預(yù)測(cè)IFN抗病毒療效的病毒學(xué)指標(biāo)［14］，而本實(shí)驗(yàn)表明PBMC IFNAR2 mRNA表達(dá)水平與這些指標(biāo)不相關(guān)。因此可得出結(jié)論，治療前PBMC IFNAR2 mRNA的表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)IFN抗丙肝病毒療效的獨(dú)立因素。

然而，F(xiàn)ujiwara等［15］的實(shí)驗(yàn)表明PBMC IFNAR2 mRNA不能替代肝臟中IFNAR2 mRNA評(píng)價(jià)IFN抗病毒療效的地位，因此仍需進(jìn)行更大樣本的實(shí)驗(yàn)研究以進(jìn)一步明確。

綜上，本實(shí)驗(yàn)表明HCV感染可上調(diào)PBMC IF?NAR2 mRNA的表達(dá)，PBMC IFNAR2 mRNA在慢性肝炎患者的表達(dá)高于肝硬化患者。抗病毒治療前，PBMC IFNAR2 mRNA的水平可作為評(píng)價(jià)IFN抗病毒療效的獨(dú)立因素。目前，長(zhǎng)效干擾素聯(lián)合利巴韋林是抗病毒治療的最佳選擇。今后應(yīng)進(jìn)行長(zhǎng)效干擾素聯(lián)合利巴韋林更大樣本的實(shí)驗(yàn)及長(zhǎng)時(shí)間的隨訪以進(jìn)一步明確此結(jié)論。

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