王雪芹，郝選明

運動免疫學(xué)研究業(yè)已證實，長期從事長時間大強(qiáng)度運動對免疫機(jī)能有非常強(qiáng)烈的負(fù)性影響［2］，表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，亞群改變；細(xì)胞毒性降低，細(xì)胞免疫功能受損；主要免疫球蛋白及補(bǔ)體含量降低；中性粒細(xì)胞吞噬作用降低；大負(fù)荷運動降低巨噬細(xì)胞的抗原提呈及MHC的表達(dá)等，說明長期大強(qiáng)度運動訓(xùn)練對細(xì)胞和體液免疫都有明顯的負(fù)性作用。為了進(jìn)一步揭示長期大強(qiáng)度運動對免疫機(jī)能及機(jī)制的影響，課題組前期進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)6周遞增負(fù)荷運動會使中樞免疫器官骨髓、胸腺中B細(xì)胞和T細(xì)胞的發(fā)育分化失衡；會影響外周免疫器官脾臟、小腸集合淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞的增殖分化、吞噬能力、IL－2表達(dá)、sIL－2R 表 達(dá) 及 凋 亡 等［3，9－11，13］。

脾臟是重要的外周免疫器官，是淋巴細(xì)胞定居、增殖和產(chǎn)生免疫應(yīng)答的場所。那么，6周遞增負(fù)荷運動會導(dǎo)致脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性和凋亡的改變，從而影響機(jī)體的免疫水平嗎？其機(jī)制又是什么？本研究主要通過觀察遞增負(fù)荷運動對脾臟淋巴細(xì)胞的增殖能力、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，△Ψm）的變化及Bax和Bcl－2 mRNA的表達(dá)情況，探討6周遞增負(fù)荷運動對脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性與凋亡及機(jī)制。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象與分組

8周齡、64只SPF級雄性SD大鼠［購自廣東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2008－0020；NO：0104976，粵監(jiān)證字F2008A002］被隨機(jī)分為對照組和實驗組［0周組（WK0）、2周組（WK2）、4周組（WK4）和6周組（WK6）］共8組，每組8只。實驗組32只進(jìn)行6周遞增強(qiáng)度訓(xùn)練；對照組32只正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行運動干預(yù)，用于判別大鼠生長對測試指標(biāo)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組指標(biāo)各周之間沒有顯著性差異（P＞0.05），表明6周生長對這些指標(biāo)沒有顯著影響。實驗組分別于第0、2、4、6周周末取脾臟并測試相關(guān)指標(biāo)。

1.2 運動方案

本研究采用6周遞增負(fù)荷運動模型（表1），本模型是課題組通過反復(fù)實驗性探索獲得的運動性免疫失衡發(fā)生、發(fā) 展 的 動 物 訓(xùn) 練 模 型［3，9，11－13］。 采 用 適 應(yīng) 性 運 動 訓(xùn) 練 （10 m／min）1周后，負(fù)荷遞增至20m／min；隨后，每周負(fù)荷增量5m／min；第6周時達(dá)到40m／min，基本達(dá)到大鼠的最大負(fù)荷強(qiáng)度。分別于第0、2、4、6周的最后一次運動后48 h，安靜狀態(tài)下無菌取脾臟。

無菌取得大鼠脾臟后，一部分用錫紙包好放在液氮中，用于mRNA的研究；一部分直接放入滅菌的PBS中，制備細(xì)胞懸液，進(jìn)行淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)和線粒體膜電位的測定。

表1 本研究運動訓(xùn)練方案一覽表Table 1 List of Exercise Plan in the Study

1.3 測試指標(biāo)與方法

1.3.1 脾臟系數(shù)的測定

在冰塊上迅速分離取脾臟，稱重，用于計算脾臟系數(shù)［脾臟系數(shù)＝脾臟重量（mg）／體重（g）×100%］。

1.3.2 淋巴細(xì)胞懸液的制備［7］及 MTT法測定淋巴細(xì)胞刺 激 指 數(shù)［5，15，21］

無菌摘取脾臟，用200目鋼網(wǎng)把脾臟研磨到PBS中，制備成細(xì)胞液；吸取淋巴細(xì)胞分層液（每8ml細(xì)胞液加3 ml分層液）置于10ml離心管中，然后將離心管傾斜45°角，將細(xì)胞液在距分層液界面1cm處沿試管壁緩慢加至分層液上面，注意保持兩者界面清晰，勿使血液混入分層液內(nèi)；將離心管放于水平式離心機(jī)內(nèi)，在18℃～20℃下，以2 000rpm離心20min。離心后，用毛細(xì)吸管吸取淋巴細(xì)胞懸液；將所得細(xì)胞懸液用PBS洗滌2次，依次以2 000 rpm、1 500rpm，離心10min；用完全 RPMI－1640定容細(xì)胞，記數(shù)細(xì)胞后再調(diào)整細(xì)胞至所需濃度。細(xì)胞活力和數(shù)目測定采用計數(shù)板法：將細(xì)胞懸液0.5ml加入試管中，后加入0.5ml 0.1%的臺盼藍(lán)染液，染色1min；鏡下觀察，不著色、體積較小、折光性強(qiáng)者為活淋巴細(xì)胞，凡染成藍(lán)色、體積較大且無光澤者為死淋巴細(xì)胞。鏡下取幾個任意視野分別計數(shù)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)。活力測定可以與細(xì)胞計數(shù)同時進(jìn)行，但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用?；罴?xì)胞數(shù)／ml＝（4個大方格內(nèi)活細(xì)胞總數(shù)／4）×2×104；活細(xì)胞數(shù)%＝活細(xì)胞數(shù)／（活細(xì)胞數(shù)＋死細(xì)胞數(shù)）×100%.

用加樣器將制備好的淋巴細(xì)胞懸液（濃度2×106／ml）加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（100μl／孔），每個樣本加6孔，6個樣本孔中，其中3孔加ConA，100μl／孔，另外3孔加培養(yǎng)液作對照，100μl／孔；置5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68h，后每孔加入10μl質(zhì)量濃度為5mg／ml的 MTT，37℃溫育4h（共72h）；每孔加入溶劑100μl，稍振蕩待甲肷產(chǎn)物充分溶解；用酶標(biāo)儀（Tecan Infinite F200）以波長570nm測定OD值，重復(fù)3次；計算SI（Stimulating Index）＝ConA刺激管中的OD均值／對照管中的OD均值。

1.3.3 線粒體膜電位測定

1.3.4 Bax、Bcl－2mRNA的測定

RNAiso Plus和SYBR○RPremix Ex TaqTM 反應(yīng)試劑購自（TaKaRa）大連寶生物公司；引物（表2）委托上海Invitrogen公司合成；采用全自動熒光定量PCR儀進(jìn)行測定。反應(yīng)結(jié)束后，PCR儀給出各反應(yīng)孔的Ct值，以甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）基因為內(nèi)參，根據(jù)公式2－△△Ct計算樣品目的基因的相對表達(dá)量。

表2 本研究GAPDH、Bax、Bcl－2的引物情況一覽表Table 2 Gene－specific Primers of GAPDH，Bax，Bcl－2

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 長期遞增負(fù)荷運動對大鼠脾系數(shù)及淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)（SI）的影響

結(jié)果顯示，6周遞增負(fù)荷運動過程中，大鼠脾臟系數(shù)是呈遞減的。與WK0組相比，WK2組的脾臟系數(shù)明顯低于WK0組，差異顯著（P＜0.05）；WK4、WK6組的脾臟系數(shù)也都明顯低于 WK0組，差異非常顯著（P＜0.01）。在6周遞增負(fù)荷運動過程中，大鼠脾臟淋巴細(xì)胞SI也明顯降低。與WK0組相比，WK4、WK6組的脾臟淋巴細(xì)胞SI都明顯低于 WK0組，差異顯著（P＜0.05）。與 WK2組相比，WK4、WK6組的脾臟淋巴細(xì)胞SI都明顯低于 WK2組，差異顯著（P＜0.05；表3）。

2.2 長期遞增負(fù)荷運動對大鼠脾臟淋巴細(xì)胞△Ψm的影響

表3 本研究大鼠脾臟淋巴細(xì)胞SI的變化一覽表Table 3 Changes of Lymphocyte SI in Spleen

表4 本研究大鼠脾臟淋巴細(xì)胞△Ψm的變化一覽表Table 4 Changes of Lymphocyte△Ψm in Spleen

圖1 本研究各組代表性JC－1檢測結(jié)果示意圖Figure 1. The Representative Results of JC－1in Groups

2.3 長期遞增負(fù)荷運動對大鼠脾臟淋巴細(xì)胞Bax mRNA表達(dá)的影響

6周遞增負(fù)荷運動過程中，Bax mRNA表達(dá)水平整體是升高的。與WK0組相比，WK2組的Bax mRNA表達(dá)升高，但沒有顯著性差異；WK4和 WK6組的Bax mRNA表達(dá)明顯升高，且差異非常顯著（P＜0.01）。與 WK2相比，WK4、WK6組的Bax mRNA表達(dá)明顯升高，差異非常顯著（P＜0.01）。與 WK4組相比，WK6組的Bax mRNA表達(dá)略有升高，但沒有顯著性差異（表5）。

2.4 長期遞增負(fù)荷運動對大鼠脾臟淋巴細(xì)胞Bcl－2mRNA表達(dá)的影響

6周遞增負(fù)荷運動過程中，Bcl－2mRNA的表達(dá)整體是降低的。與 WK0組相比，WK2組的Bcl－2mRNA表達(dá)下降，差異顯著（P＜0.05）；WK4和 WK6組的 Bcl－2mRNA表達(dá)也明顯下降，差異非常顯著（P＜0.01）。與 WK2組相比，WK4、WK6組的Bcl－2mRNA表達(dá)明顯降低，差異非常顯著（P＜0.01）。與 WK4組相比，WK6組的Bcl－2mRNA表達(dá)略有下降，但沒有顯著性差異（表5）。

2.5 長期遞增負(fù)荷運動對脾臟淋巴細(xì)胞Bcl－2／Bax的影響

6周遞增負(fù)荷運動過程中，Bcl－2／Bax比值整體表現(xiàn)為明顯降低。與 WK0組相比，WK2組的Bcl－2／Bax比值明顯下降，差異顯著（P＜0.05）；WK4和 WK6組的 Bcl－2／Bax比值也明顯下降，差異非常顯著（P＜0.01）。與 WK2組相比，WK4、WK6組的Bcl－2／Bax明顯減小，差異非常顯著（P＜0.05）；與 WK4組相比，WK6組的 Bcl－2／Bax有所下降，但沒有顯著性差異（表5）。

表5 本研究大鼠脾臟淋巴細(xì)胞SI的變化以及Bax和Bcl－2mRNA的變化一覽表Table 5 Changes of Lymphocyte Bax mRNA and Bcl－2mRNA in Spleen

3 討論

脾臟是體內(nèi)主要的免疫器官，其重量及器官指數(shù)反映了免疫器官的發(fā)育情況，能間接的反映機(jī)體的免疫水平。本研究結(jié)果顯示，6周遞增負(fù)荷運動可使大鼠的脾臟系數(shù)降低，且隨著運動時間的延長和強(qiáng)度的增加，脾臟系數(shù)下降明顯。與筆者前期的研究一致［11］。另外，課題組前期的脾臟HE染色結(jié)果顯示，脾臟的內(nèi)部結(jié)構(gòu)隨著運動時間的延長、負(fù)荷的不斷增加，出現(xiàn)了紅髓、白髓、邊緣區(qū)內(nèi)淋巴細(xì)胞的不斷減少，從第2周開始，脾小體內(nèi)出現(xiàn)了生發(fā)中心，紅髓、白髓、邊緣區(qū)之間的界限也開始模糊不清［5］。提示，6周遞增負(fù)荷運動不僅影響了脾臟的正常質(zhì)量，也在很大程度上損傷了脾臟的結(jié)構(gòu)，可能導(dǎo)致了脾臟的萎縮。

通過分析6周遞增負(fù)荷運動對脾臟系數(shù)及脾臟結(jié)構(gòu)的影響，不難發(fā)現(xiàn)，免疫器官脾臟對6周遞增負(fù)荷運動的反應(yīng)是明顯的，為了進(jìn)一步了解機(jī)體的免疫機(jī)能狀態(tài)，本實驗測定了脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性，淋巴細(xì)胞增殖活性的測試是評價體內(nèi)淋巴細(xì)胞功能狀態(tài)的一個重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，6周遞增負(fù)荷運動使 WK4、WK6組大鼠的脾淋巴細(xì)胞的增殖活性明顯低于WK0、WK2組。說明6周遞增負(fù)荷運動降低了脾淋巴細(xì)胞的增殖活性，使淋巴細(xì)胞功能下降，影響了機(jī)體的免疫水平。矯瑋等［4］報道，力竭運動后T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化明顯降低。Green等［18，19］研究也發(fā)現(xiàn)，劇烈運動會降低體外T淋巴細(xì)胞的增殖應(yīng)答能力。

另外，淋巴細(xì)胞凋亡增加也會影響機(jī)體的正常免疫功能。大量資料顯示，力竭運動后外周血和免疫器官淋巴細(xì)胞 凋 亡 增 加 ，并 往 往 會 伴 隨 免 疫 機(jī) 能 下 降［6－7，14，22］。 于 是 ，本實驗對各組大鼠脾臟淋巴細(xì)胞的△Ψm進(jìn)行了測定，因為線粒體既是細(xì)胞的動力工廠，又是細(xì)胞凋亡信號的提供者?！鳓穖是多種細(xì)胞凋亡過程中最重要的事件之一［16，20］。本研 究 發(fā) 現(xiàn)，在 遞 增 負(fù) 荷 運 動 過 程 中，WK2、WK4、WK6組大鼠的△Ψm明顯低于0周組。提示，6周遞增負(fù)荷運動降低了大鼠脾臟淋巴細(xì)胞的△Ψm，使脾臟淋巴細(xì)胞凋亡增加。說明6周遞增負(fù)荷運動對脾臟淋巴細(xì)胞的增殖活性產(chǎn)生影響的同時也影響淋巴細(xì)胞凋亡，且隨著運動時間和強(qiáng)度的增加，影響更加顯著。

凋亡又稱程序性死亡，發(fā)生的原因和途徑是復(fù)雜多樣的，許多基因參與細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控。其中，Bcl－2家族是目前最受關(guān)注的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族，目前家族中人們共發(fā)現(xiàn)30個成員，包括抑制凋亡蛋白 Bcl－2、Bcl－x、Bcl－XL等 ，促 進(jìn) 凋 亡 蛋 白 包 括 Bax、Bcl－10、Bid 等［17，24，26］。Bax接到凋亡信息后，會插入線粒體膜中，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活下游因子，裂解底物，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［23］。另外，Bax和Bcl－2的作用是相互拮抗的，當(dāng)Bax同源二聚體形成，會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而Bcl－2表達(dá)上升時，Bax二聚體會分開，從而組織抑制凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，隨著運動負(fù)荷的遞增，WK4和WK6組大鼠脾臟淋巴細(xì)胞Bax mRNA表達(dá)明顯增加；而 WK2、WK4和 WK6組大鼠脾臟淋巴細(xì)胞Bcl－2mRNA表達(dá)明顯降低；WK2、WK4和WK6組大鼠周脾臟淋巴細(xì)胞Bcl－2／Bax比值也明顯降低。另外，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，6周遞增負(fù)荷運動過程中，大鼠小腸集合淋巴結(jié)Bax蛋白表達(dá)增加，而Bcl－2蛋白表達(dá)下降，Bcl－2／Bax的比值也下降，得出大鼠小腸集合淋巴結(jié)細(xì)胞凋亡增加［8］，即隨著運動時間延長和強(qiáng)度的加大，脾臟淋巴細(xì)胞的Bcl－2／Bax比值明顯減小，△Ψm也明顯降低。說明6周遞增負(fù)荷運動可能是通過改變調(diào)控基因Bax mRNA和Bcl－2mRNA的表達(dá)而使細(xì)胞凋亡增加的，而細(xì)胞凋亡增加可能是長時間大強(qiáng)度運動導(dǎo)致機(jī)體免疫水平下降的原因之一。

4 結(jié)論

1.大鼠脾系數(shù)變小，脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性降低，可能是6周遞增負(fù)荷運動造成機(jī)體免疫水平下降的原因之一。

2.脾臟淋巴細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降、細(xì)胞凋亡增加很可能是6周遞增負(fù)荷運動造成機(jī)體免疫水平下降的另一原因。其機(jī)制可能是通過改變調(diào)控基因Bax mRNA和Bcl－2mRNA表達(dá)，而使脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞凋亡增加，影響機(jī)體免疫水平。

3.長期遞增負(fù)荷運動過程中，大鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡的增加可能是造成淋巴細(xì)胞增殖活性降低的因素之一，但具體機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究證實。

［1］常徽，王湛，袁麗佳，等.桑葚花色苷提取物對乳腺癌細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位的影響［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，22（12）：4236－4240.

［2］鄧樹勛，陳佩杰，喬德才.運動生理學(xué)導(dǎo)論［M］.北京：北京體育大學(xué)出版社，2007：112－113.

［3］耿青青.長期遞增負(fù)荷運動對調(diào)控骨髓B細(xì)胞發(fā)育分化的E2A、EBF、PAX5的影響［J］.體育科學(xué)，2012，32（11）：76－82.

［4］矯瑋，佟啟良，王耐勤，等.力竭運動時阿片肽對免疫機(jī)能的作用［J］.體育科學(xué)，2000，20（3）：56－58.

［5］李金煥.6周遞增負(fù)荷運動中大鼠胸腺和脾臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化特征［J］.南京體育學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，11（1）：24－28.

［6］李靖，李皓，張?zhí)N琨.紅景天對力竭運動誘導(dǎo)的大鼠淋巴細(xì)胞凋亡的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2005，20（4）：240－242.

［7］林清華.免疫學(xué)實驗［M］.武漢：武漢大學(xué)出版社，1999：50.

［8］覃飛，郝選明.長期遞增負(fù)荷運動對小腸集合淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)及淋巴細(xì)胞凋亡的影響［J］.體育學(xué)刊，2012，19（1）：134－138.

［9］唐亮.大鼠細(xì)胞免疫功能對六周遞增負(fù)荷運動的應(yīng)答性和適應(yīng)性特征［D］.華南師范大學(xué)碩士學(xué)位論文，2007.

［10］王雪芹.運動與免疫研究進(jìn)展［J］.中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2012，21（12）：1137－1144.

［11］王雪芹.T細(xì)胞活性與巨噬細(xì)胞吞噬能力對長期遞增負(fù)荷運動的應(yīng)答和適應(yīng)特征［D］.華南師范大學(xué)碩士學(xué)位論文，2005.

［12］王茂葉.6周遞增跑臺運動對大鼠血清Th1／Th2平衡和IL－6的影響［J］.體育科學(xué)，2009，10（29）：46－50.

［13］張琳.運動性免疫抑制發(fā)展中T細(xì)胞的發(fā)育與調(diào)節(jié)［D］.廣州：華南師范大學(xué)博士學(xué)位論文，2010.

［14］張福龍.不同訓(xùn)練負(fù)荷后散打運動員血液淋巴細(xì)胞凋亡的研究［D］.中北大學(xué)碩士學(xué)位論文，2010.

［15］朱立平，陳學(xué)清.免疫學(xué)常用實驗方法［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2000：193.

［16］ADRAIN C，MARTIN S J.The mitochondrial apoptosome：a killer unleashed by the cytochrome seas［J］.Trends Biochem Sci，2001，26（6）：390－397.

［17］BOUILLET P，STRASSER A.BH3－only proteins－evolutionarily conserved proapoptotic Bcl－2family members essential for initiating programmed cell death［J］.J Cell Sci，2002，115（Pt 8）：1567－1574.

［18］GREEN K J.Improving understanding of exercise effects on in vitro T－lymphocyte function－－the role of fluorescent cell division tracking［J］.Exe Immunol Rev，2002，8：101－105.

［19］GREEN K J，ROWBOTTOM D G.Exercise－induced changes to in vitro T－lymphocyte mitogen responses using CFSE［J］.J Appl Physiol，2003，95（1）：57－63.

［20］LY J D，GRUBB D R，LAWEN A.The mitochondrial membrane potential（deltapsi（m））in apoptosis；an update［J］.Apoptosis.2003，8（2）：115－128.

［21］MIN B S，LEE S Y，KIM J H，et al.Anti－complement activity of constituents from the stem－bark of Juglans mandshurica［J］.Biol Pharm Bull，2003，26（7）：1042－1044.

［22］MOOREN F C，BL MING D，LEVHTERMANN A，et al.Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise［J］.J Appl Physiol，2002，94（1）：147－153.

［23］OLTVAI Z N，MILLIMAN C L，KORSMEYER S J.Bcl－2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog，Bax，that accelerates programmed cell death ［J］.Cell，1993，74（4）：609－619.

［24］TSUKAHARA S，YAMAMOTO S，TIN－TIN－WIN－SHWE，et al.Inhalation of low－level formaldehyde increase the Bcl－2／Bax expression ratio in the hippocampus of immunologically sensitized mice［J］.Neuroimmunomodulation，2006，13（2）：63－68.

［25］WANG Z，TANG X，LI Y，et al.20－Hydroxyeicosatetraenoic acid inhibits the apoptotic responses in pulmonary artery smooth muscle cells［J］.Eur J Pharmacol，2008，588（1）：9－17.

［26］YOULE R J，SRASSER A.The BCL－2protein family：opposing activities that mediate cell death［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9（1）：47－59.