孫明君，陳雍碩，鄭小龍，陳啟

（1.山東出入境檢驗檢疫局食品農(nóng)產(chǎn)品檢測中心，山東 青島 266002；2.GE Healthcare，上海 200000；3.浙江省疾控中心理化分析中心，浙江 杭州 310027）

葉酸是維持人體正常機能與代謝活動不可或缺的水溶性B族維生素，人體無法自行制造合成，必須額外補充。奶粉作為嬰幼兒主要食品，其中葉酸的含量對嬰兒健康的影響尤為重要。國家相關標準限制了奶粉中葉酸的添加量，但仍有不少市售奶粉存在葉酸的不合理添加。世界上許多國家和組織對奶粉中葉酸含量的檢測建立了限制標準，例如AOAC OfficialMethod 992.05 Total Folate（Pteroylglutamic Acid）in Infant Formula Microbiological Methods First Action 1992 Final Action 1995。截至2010年，奶粉中葉酸主要檢測方法有微生物檢測法，理化檢測法如HPLC和免疫檢測法，這些方法樣品前處理較為復雜，檢測時間較長。

基于表面等離子體共振（SPR）技術的生物傳感器是近年來發(fā)展起來的一種檢測技術，具有實時監(jiān)測分子間的相互作用、無需標記、定量準確等特點，已被廣泛應用于藥物研究[1-2]、食品分析[3-4]、環(huán)境監(jiān)測[5-6]等領域。20世紀90年代瑞典的Biacore公司將SPR生物傳感器技術引入獸藥殘留分析中，截至21世紀10年代已生產(chǎn)出多種檢測試劑盒。國內(nèi)已有利用SPR技術進行牛奶中磺胺甲惡唑檢測研究[7]的報道。該技術的檢測方法，具有樣品前處理相對簡單、高特異性、分析快捷、定量準確等優(yōu)勢[8]。本研究利用SPR技術，建立奶粉中葉酸的檢測方法。該方法簡單、快捷、靈敏度高，重復性好，適用于大規(guī)模的奶粉中葉酸的含量檢測。

本實驗基于Biacore 3000型表面等離子共振儀，采用競爭抑制法作為檢測方法，測定嬰幼兒配方奶粉中的葉酸含量。在奶粉樣品中加入已知濃度的葉酸結合蛋白（folic acid binding protein，F(xiàn)ABP），混合后的樣品被流過預先包被過葉酸分子的傳感芯片。樣品中的葉酸分子會和FABP進行結合，而剩余的游離FABP則結合到芯片表面上的葉酸分子，因結合而產(chǎn)生的信號由儀器實時記錄并輸出。如果樣品中的葉酸分子濃度越高，則游離的FABP越少，產(chǎn)生的信號也相對較低，反之亦然。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

奶粉（市售）；葉酸傳感芯片（GE Healthcare）；葉酸結合蛋白（GE Healthcare）；超純水、Pall 0.22μm 濾膜；1 mL一次性無菌注射器；離心管（1.5、2、50 mL）；100 mL棕色容量瓶；96孔板（圓底）；BT224S天平：Sartorius；PICO17離心機：Thermo；Biacore3000型表面等離子體共振儀：GE Healthcare；MLS-3750 高溫滅菌鍋：SANYO。

1.2 樣品的前處理

精確稱取1g奶粉樣品到50mL離心管中，加35mL超純水，振蕩至完全溶解后于高溫滅菌鍋中105℃10 min（使樣品中蛋白質(zhì)失活）。取出冷卻至室溫，用超純水將體積補到40mL，再用移液槍吸2mL樣液至2mL離心管中，13000 r/min離心10 min，用1 mL一次性無菌注射器吸取1 mL中間的溶液部分（小心避開表層的脂肪層和底部的沉淀）過0.22μm濾膜到1.5 mL離心管中。

1.3 標準曲線的構建

用去離子水將標準樣品母液（100μg/mL）稀釋為1.23、3.70、11.1、33.3、80.0ng/mL。

該方法葉酸檢測范圍在2.0ng/mL～70ng/mL，最佳檢測范圍在10ng/mL～50ng/mL之間。

1.4 優(yōu)化芯片和再生試劑

將葉酸傳感芯片放入設備。緩沖液使用HBS-EP（0.01mol/LHEPES、0.15mol/LNaCl、3mmol/LEDTA、0.005%Surfactantp20），流速40μL/min。然后將50mmol/L氫氧化鈉注射入系統(tǒng)，每次60 s，連續(xù)進樣3次。再生試劑為50mmol/L氫氧化鈉，流速40μL/min，進樣時間30s。

1.5 樣品檢測

將樣品和標準樣品按照編輯好的程序并對應樣品位置和體積用移液槍加樣。加完樣品后用鋁箔條封蓋96孔板，并放入儀器樣品盤中。在1.5 mL離心管中分別加入對應體積的葉酸結合蛋白和再生試劑，并放入樣品盤中，保存文件后，點擊開始進行檢測。

1.6 回收率試驗

從10個檢測樣品中隨機選取3個樣品，每個樣品加標量20ng/mL，做回收率試驗。

2 結果與分析

2.1 再生條件的優(yōu)化與芯片穩(wěn)定性

采用甘氨酸、氫氧化鈉以及氯化鈉等試劑進行再生條件篩選。最終確定50mmol/L氫氧化鈉，流速40μL/min，進樣30 s作為再生條件。

將葉酸結合蛋白按1∶100稀釋，進樣時間60 s，流速40μL/min。再生條件為50 mmol/L氫氧化鈉，流速40μL/mL，進樣30 s。依照進樣—再生的順序作為一個循環(huán)，共進行50個循環(huán)進行芯片穩(wěn)定性測試。結果如圖。從基線信號和結合信號的趨勢可以看出，每一次再生都可以將結合到芯片上的葉酸結合蛋白完全洗脫下，同時對蛋白的再次結合影響微乎其微。芯片穩(wěn)定性測試結果見圖1。

圖1 芯片穩(wěn)定性測試Fig.1 Stability test of chip

2.2 標準曲線的建立

根據(jù)在不同濃度下得到的結合信號，采用四因子非線性回歸進行擬合，得到標準曲線見圖2。

2.3 不同方法的樣品測定結果的比較

目前，國標GB5413.16-2010《嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測定》采用微生物法來測定嬰幼兒食品和乳品中的葉酸含量，所以我們使用商品化試劑盒（拜發(fā)公司）采用微生物微量滴定法來作方法比較。對市售10個奶粉分別做了生物傳感器與微生物法檢測葉酸的試驗，結果見表1。

圖2 葉酸標準曲線Fig.2 Calibration curve or folic acid

表1 兩種方法檢測葉酸的數(shù)據(jù)結果Table 1 Analyses of comparing the data of folic acid assay in two different methods

日內(nèi)精密度結果見表2。

表2 日內(nèi)精密度數(shù)據(jù)（n=7）Table 2 Data of the intra-day precision

從試驗數(shù)據(jù)來看，生物傳感器方法所得結果與微生物法檢測結果基本一致，相對標準偏差在10%以內(nèi)，日內(nèi)精密度試驗所得結果也比較滿意。

2.4 回收率

樣品回收率結果見表3。

表3 樣品回收率數(shù)據(jù)Table 3 Data of sample recovery rate

從10個檢測樣品中隨機選取3個樣品，編號分別是3、6、8號，每個樣品加標量20ng/mL，并按照樣品檢測步驟做回收率試驗。通過所檢測的數(shù)據(jù)，計算后得到3號樣品回收率為91.94%、6號樣品回收率為96.41%、8號樣品回收率為85.49%，結果在預期范圍之內(nèi)。

3 結論

本研究通過對照奶粉中添加不同質(zhì)量濃度的葉酸得到標準曲線，與緩沖液[9]相比，更加合理，減少了奶粉樣品中其他物質(zhì)的影響，最低檢測質(zhì)量濃度為0.006μg/100 g。并且優(yōu)化了再生條件，提高了芯片的穩(wěn)定性。從10個樣品的檢測結果來看，與微生物法檢測結果基本一致，相對標準偏差小于10%，日內(nèi)精密度試驗RSD為2.59%，隨機選取的3個樣品回收率在85.49%～96.41%之間。樣品只需簡單的稀釋、離心處理即可直接檢測，可以實測奶粉樣品中的葉酸質(zhì)量濃度范圍為2.0ng/mL～70ng/mL。單個樣品測量用時9 min，可在4 h內(nèi)完成20個樣品的結檢測。相對傳統(tǒng)的HPLC和GC檢測技術，本方法樣品前處理簡單，同時也縮短了測量時間，是一種高效便捷的測量方法。

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