梁君妮，劉寧，曹鵬，孫磊麗，牟妍，關(guān)麗麗，李彥，沙美蘭，徐娟

（1.煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東煙臺(tái)264000；2.青島科技大學(xué)，山東青島264200）

氟喹諾酮類(lèi)（Fluoroquinolones），又稱(chēng)吡啶酮酸類(lèi)藥物，屬于化學(xué)合成抗菌藥。具有抗菌譜廣、殺菌力強(qiáng)、使用方便、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)[1]。因此被廣泛用于治療小動(dòng)物、禽類(lèi)、家畜及水生動(dòng)物由細(xì)菌、支原體引起的消化、呼吸、泌尿、生殖等系統(tǒng)疾病以及皮膚軟組織的感染性疾病[2-4]。但是該類(lèi)藥物本身具有一定毒性，超劑量或長(zhǎng)期反復(fù)使用該藥可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)等不良反應(yīng)[5]。隨著社會(huì)的發(fā)展和生活水平的不斷提高，食品安全問(wèn)題愈來(lái)愈受到關(guān)注。飼料是動(dòng)物的直接食品，它的安全與否直接關(guān)系到動(dòng)物性食品的安全，飼料的不安全因素會(huì)通過(guò)食物鏈對(duì)人類(lèi)的健康造成危害。人若長(zhǎng)期食用含抗生素的畜禽產(chǎn)品，可產(chǎn)生耐藥性及其他不良反應(yīng)[6]。為了保障畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量安全和人類(lèi)健康，已禁止喹諾酮類(lèi)藥物作為藥物添加劑在商品飼料中添加[7]，但是濫用該類(lèi)藥物的情況依然存在，必須從整個(gè)食物鏈的源頭--飼料抓起。因此建立一種同時(shí)檢測(cè)飼料中多種喹諾酮類(lèi)藥物的方法具有重要意義。

目前飼料中氟喹諾酮類(lèi)藥物檢測(cè)主要采用高效液相色譜法[8-10]、毛細(xì)管電泳法[11]和液質(zhì)聯(lián)用法[12-18]。高效液相色譜法分析時(shí)間長(zhǎng)，定性能力差，假陽(yáng)性率高。液質(zhì)聯(lián)用法是近幾年興起的新技術(shù)，與液相色譜法比較具有更高的靈敏度、選擇性。本研究用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)飼料中16 種氟喹諾酮類(lèi)藥物，通過(guò)對(duì)前處理方法和質(zhì)譜方法等的研究，建立一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1200 型高效液相色譜、6410B 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent 公司；CF16RXⅡ型高速冷凍離心機(jī)：日本Hitachi 公司；Milli-Q 超純水：美國(guó)Millipore 公司；氮吹濃縮儀：美國(guó)Organomation Associates 公司；RE-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI 公司；SB5200 型超聲波清洗機(jī)：SHANGHAI BRANSON；Oasis MCX 固相萃取小柱：美國(guó)Waters 公司。

標(biāo)準(zhǔn)品：恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、二氟沙星、丹諾沙星、沙拉沙星、麻保沙星、萘啶酸、氟甲喹、惡喹酸、依諾沙星、洛美沙星、司帕沙星、奧比沙星，均購(gòu)于Dr.Ehrenstorfer 公司，純度>95%，

乙腈、甲醇（色譜純，德國(guó)Merk 公司），乙酸、甲酸（色譜純，TEDIA），水為超純水。飼料均購(gòu)于市場(chǎng)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

1.2.1 16種喹諾酮類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

精密稱(chēng)取16 種氟喹諾酮類(lèi)藥物，用30 mmol/L 氫氧化鈉溶解后移入100 mL 容量瓶中，并稀釋至刻度，配制成含量為100.0 mg/kg 的溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液

將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用30 mmol/L 氫氧化鈉稀釋成1.0 mg/kg。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)使用液

將標(biāo)準(zhǔn)中間液用30 mmol/L 氫氧化鈉依次稀釋至100.0、50.0、20.0、10.0、5.0 μg/kg 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，待用。

以上標(biāo)準(zhǔn)溶液均于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g 樣品，置于50 mL 離心管中，加入適量水浸泡1 h（保證飼料樣品完全潤(rùn)濕），加入1%乙酸的乙腈溶液15 mL，超聲提取20 min，振蕩提取5 min，5 000 r/min 離心10 min，收集上清液于雞心瓶中，重復(fù)上述提取步驟一次，合并上清液，40 ℃快速濃縮至干。向雞心瓶中加入1.0 mL 甲醇，渦混溶解殘?jiān)?，加? mL超純水，混合均勻，分取10 mL 作為上樣液，使用Oasis MCX 固相萃取柱進(jìn)行凈化處理。依次用3 mL 甲醇及3 mL 超純水活化MCX 固相萃取柱，將提取液以不超過(guò)1.0 mL/min 的速度通過(guò)固相萃取柱，加入3 mL 水及3 mL 甲醇淋洗，抽干。5.0 mL 氨化甲醇（5%氨水）洗脫，洗脫液于40 ℃氮吹儀吹干，加入1.0 mL 乙腈-0.1%甲酸水溶液（20 ∶80/體積比）溶解殘?jiān)^(guò)0.2 μm的濾膜，待測(cè)。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1×150 mm，3.5 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B 為乙腈；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～5.00 min，10%B；5.00 min～8.00 min，20%B～90%B；8.00 min～9.00 min，90%B；9.01 min～12.00 min，90%B～10%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+），掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），Delta EMV：500 V，霧化氣壓力：35 psi，干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流速：600 L/min，毛細(xì)管電壓：4 000 V。質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 16 種喹諾酮類(lèi)的質(zhì)譜條件Table 1 MS/MS conditions of 16 Quinolones

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇

2.1.1 提取方法的優(yōu)化

本方法的基質(zhì)飼料吸濕性很強(qiáng)，如果直接用提取溶劑提取，會(huì)造成大量損失，回收率大大下降。乙酸的加入是沉淀蛋白。本方法通過(guò)對(duì)提取溶劑種類(lèi)、乙酸添加的比例、提取方法、提取液用量、提取時(shí)間等因素對(duì)提取效果影響的考察，發(fā)現(xiàn)在樣品中加入適量水浸泡，加入1%乙酸的乙腈溶液15 mL，超聲提取20 min，振蕩提取5 min，重復(fù)提取兩次，提取效果較好。

2.1.2 凈化方法的優(yōu)化

由于飼料樣品基質(zhì)復(fù)雜，如果采用正己烷凈化效果較差，所以選擇SPE 固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理[19]?？疾炝薕asis HLB、堿性氧化鋁、Oasis MCX 柱3 種固相萃取柱及淋洗液、洗脫液種類(lèi)、洗脫液體積等對(duì)回收率和凈化效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Oasis MCX效果最好，每種藥物均能獲得較高的回收率，且能很好的去除雜質(zhì)干擾，見(jiàn)圖1。因此最終選擇Oasis MCX柱進(jìn)行凈化。

圖1 不同凈化柱對(duì)回收率的影響Fig.1 Effects on the recoveries of 16 quinolones with different columns

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性關(guān)系

用16 種氟喹諾酮類(lèi)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別為100.0、50.0、20.0、10.0、5.0 μg/kg，按上述色譜和質(zhì)譜條件測(cè)定其峰面積，以質(zhì)量濃度X（μg/kg）為橫坐標(biāo)，峰面積的比值Y 為縱坐標(biāo)，繪制16 種氟喹諾酮類(lèi)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見(jiàn)表2。

表2 16 種氟喹諾酮類(lèi)藥物的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Equations of linear regression and correlation coefficients of 16 veterinary quinolones

結(jié)果表明，16 種氟喹諾酮類(lèi)藥物濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍：5.0 μg/kg～100.0 μg/kg。

2.2.2 檢測(cè)低限

按所建立的色譜條件，以3 倍噪音比作為檢測(cè)低限，測(cè)得本方法16 種氟喹諾酮類(lèi)藥物的測(cè)定低限均可以達(dá)到10.0 μg/kg，滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)和國(guó)際對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物殘留監(jiān)控的要求。

2.2.3 基質(zhì)效應(yīng)的消除

由于空白樣品基質(zhì)溶液對(duì)16 種氟喹諾酮類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有不同程度的影響，本文采用配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液用于定量的方法，很好的消除了基質(zhì)影響，完全能滿(mǎn)足殘留檢測(cè)的要求。

2.2.4 方法的靈敏度和精確度

以空白飼料為樣品，制備添加10.0、20.0、100.0 μg/kg 3 個(gè)水平的16 種氟喹諾酮類(lèi)藥物混標(biāo)，制成模擬加標(biāo)樣品，按上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6 個(gè)樣品，同時(shí)做空白對(duì)照。所得到的樣品中各待測(cè)組分的添加回收率均70.7%～86.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3.8%～9.2%，方法準(zhǔn)確度及精密度滿(mǎn)足要求。

保留時(shí)間（min）：恩諾沙星（7.125）、環(huán)丙沙星（6.307）、氧氟沙星（6.038）、諾氟沙星（6.039）、培氟沙星（6.220）、二氟沙星（7.757）、丹諾沙星（10.612）、沙拉沙星（7.718）、麻保沙星（8.961）、萘啶酸（8.896）、氟甲喹（8.481）、惡喹酸（8.481）、依諾沙星（5.662）、洛美沙星（5.535）、司帕沙星（4.090）、奧比沙星（7.261）。

飼料添加濃度為10.0 μg/kg 的樣品的LC-MS/MS TIC 圖和部分選擇離子流圖譜圖見(jiàn)圖2 和圖3。

圖2 TIC 圖Fig.2 Total iron chromatograms

3 結(jié)論

圖3 添加10.0 μg/kg 16 種氟喹諾酮類(lèi)飼料樣品的部分選擇離子流圖Fig.3 Some selected ion chromatograms of 16 quinolones in the feed adding 10.0 μg/kg

建立了飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、二氟沙星、丹諾沙星、沙拉沙星、麻保沙星、萘啶酸、氟甲喹、惡喹酸、依諾沙星、洛美沙星、司帕沙星、奧比沙星16 種氟喹諾酮類(lèi)殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。試樣用水浸泡1 h，1%乙酸的乙腈溶液提取，Oasis MCX 固相萃取柱凈化，以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，HPLC-MS/MS 法檢測(cè)，同時(shí)定性、定量測(cè)定16 種氟喹諾酮類(lèi)抗生素殘留。16 種氟喹諾酮類(lèi)抗生素在色譜柱上分離效果較好，回收率在70.7%～86.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.8%～9.2%之間，均能滿(mǎn)足獸藥殘留分析的要求，方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速，為飼料中多種獸藥殘留測(cè)定提供了可靠的前處理方法和檢測(cè)手段。

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