湯陳生，黃金水，楊 希，洪永輝，何學(xué)友

(1．福建省林業(yè)科學(xué)研究院，福建福州350012;2．福建省漳平五一國(guó)有林場(chǎng)，福建漳平364400)

松材線蟲病在我國(guó)不斷猖獗危害，新的疫點(diǎn)時(shí)有發(fā)生，危害樹種由早期的黑松Pinus thunbergii轉(zhuǎn)移到現(xiàn)在以馬尾松P．massoniana為主(高景斌等，2005)。馬尾松是我國(guó)南方主要造林樹種，由于其具有耐瘠薄的生長(zhǎng)特性，是一種非常好的生態(tài)造林先鋒樹種。對(duì)松材線蟲病的防治方法多種多樣，但往往受到人力和財(cái)力的影響，以及清理病害的困難、傳播擴(kuò)散途徑的復(fù)雜性，很難獲得較好的控制效果。松材線蟲病日益威脅著我國(guó)南方地區(qū)的松樹安全;另外，化學(xué)防治污染環(huán)境，帶來(lái)新的次生性危害，造成更多的經(jīng)濟(jì)損失。盡管目前對(duì)于該病害防治仍在不斷開展，但一直未取得較好控制效果，尋找更為安全、有效的防治和控制方法十分迫切。所以，探索和開辟新的防治措施是一項(xiàng)非常重要的事情。馬尾松抗病品種的開發(fā)及運(yùn)用，能夠阻止或極大程度上延緩該病的發(fā)生和危害，對(duì)生態(tài)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著十分重大的意義。國(guó)內(nèi)外對(duì)松樹抗松材線蟲的特性已進(jìn)行了不少研究(焦國(guó)堯等，1996;汪企明等，1992;王斐和申荷麗，2004;楊寶君等，1987，1993;徐福元等，1994，1998;徐福元和葛明宏，1996;Kurode and Ito，1992)，但報(bào)道結(jié)果不太一致。因此，從福建實(shí)際出發(fā)，擬通過人工接種，初步篩選出供生產(chǎn)上應(yīng)用的抗病品系，顯得尤為重要。

1 材料與方法

1．1 材料來(lái)源

1．1．1 供試馬尾松 供試馬尾松來(lái)源于福建省漳平五一國(guó)有林場(chǎng)，目前生產(chǎn)上推廣的12個(gè)馬尾松品系。這12個(gè)優(yōu)良家系原產(chǎn)地分布在南平(A、B)2個(gè)、三明(C、D、E、G、H)5個(gè)、龍巖(K、L)2個(gè)、漳州(F)1個(gè)、泉州(I、J)2個(gè)。3年生盆栽苗的平均地徑為2．678 cm，平均樹高為1．486 m。

1．1．2 供試松材線蟲

(1)松材線蟲準(zhǔn)備 2008年12月在廈門島內(nèi)當(dāng)年松材線蟲致死的枯死樹樣本中選取5 cm的木塊，按自來(lái)水洗凈→99．9%酒精液沖淋1遍→滅菌水洗3次→切碎→貝曼漏斗法分離→用螺口指形管離心的方法收集供試PWN蟲株，將供試PWN蟲株放在1．5%乳酸溶液中滅菌1 h后，再用滅菌水洗3次后備用。在超凈工作臺(tái)中將其分別接種到PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的多毛孢菌絲中，放在恒溫培養(yǎng)箱中，在25℃溫度下初代培養(yǎng)。(具體的分離、培養(yǎng)技術(shù)詳見附件1已正式發(fā)表論文)。

(2)松材線蟲大量增殖 將玉米裝在三角瓶中用水浸泡24h，經(jīng)120℃、1．8大氣壓、間歇2次15 min滅菌，待冷卻后接種多毛孢;在25℃溫度下培養(yǎng)10 d后備用。從備用有松材線蟲增殖的PDA培養(yǎng)基中，切取0．5cm×0．5 cm的培養(yǎng)基切塊，接種在玉米培養(yǎng)基的菌絲上，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中，經(jīng)2周后，每個(gè)三角瓶的水中有大量松材線蟲，用貝曼漏斗法分離→離心→蒸溜水沖洗→貝曼漏斗收集(徐福元和葛明宏，1996)，反復(fù)收洗4～5次后，收集到大量松材線蟲備用。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 接種方法 采用人工皮接法。用消毒解剖刀在松苗中偏下的莖干上割開樹皮，深達(dá)木質(zhì)部，作為接種傷口。掀開樹皮，塞入大小合適的滅菌棉球;再在傷口的下方扎一塑料薄膜袋，其呈倒圓錐體，口徑約7 cm，高約10 cm，袋底部及接口處用封口膜纏緊，確保不漏水;將樹皮(傷口)和棉球包圍其中。最后用微量移液器注入線蟲懸浮液，再加入適量的無(wú)菌水，以免線蟲因水分不足而死亡。對(duì)照組加入無(wú)菌水。接種后的第一天每2-3 h補(bǔ)充無(wú)菌水，保證24 h內(nèi)袋中有水。24 h后定期澆水，并適度控制水量，避免干旱脅迫或水分過多。

1．2．2 接種測(cè)定 2009年開始對(duì)3年生馬尾松盆栽苗進(jìn)行第1次人工接種測(cè)定，接種量為8 000條/株，接種時(shí)間為9月10日，翌年2月將完全健康的植株全部集中，供二次接種使用。從第1次接種后病死的松苗體上分離松材線蟲，經(jīng)大量增殖后，于2010年5月12日進(jìn)行2次接種，再?gòu)慕臃N死亡的松苗分離線蟲并擴(kuò)繁，于2011年4月18日進(jìn)行第3次接種，接種方法同上。接種后每天觀察松苗的發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病級(jí)值，計(jì)算感病率、感病指數(shù)。統(tǒng)計(jì)接種后90 d的死亡率。

病株分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):0級(jí)(不感病，針葉正常)。1，2，3級(jí)(病情輕，1/3針葉褪綠發(fā)暗;病情中等，l/3-1/2針葉發(fā)暗變黃;病情較重，1/2-3/4針葉枯黃)。4級(jí)(病情嚴(yán)重，3/4以上針葉枯黃，瀕死或死亡)(汪企明等，1997)。

感病指數(shù)=∑(各級(jí)株數(shù)×各級(jí)代表數(shù)值)/(調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最重級(jí)的代表數(shù)值)×100

1．2．3 生長(zhǎng)性狀測(cè)定 于2009、2010、2011年的11月分別測(cè)定各馬尾松品系的地徑、樹高值，調(diào)查死亡率和天牛取食情況，對(duì)枯死苗木及時(shí)開展松材線蟲分離鑒定，確定其死亡原因。

1．2．4 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)整理與分析均采用Excel、DPS等軟件進(jìn)行處理(唐啟義和馮明光，2002)。

2 結(jié)果與分析

2．1 馬尾松抗病品系的篩選

2009-2011年以8 000條/株的接線量進(jìn)行三次接種后，每天調(diào)查各馬尾松品系的感病情況，根據(jù)病株分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)發(fā)病級(jí)值，計(jì)算出感病指數(shù)，90 d后統(tǒng)計(jì)各品系的生存率。結(jié)果(表1)顯示，3次接種測(cè)定90 d后的馬尾松生存率不盡相同，也沒有顯著的正負(fù)相關(guān)關(guān)系，但是單一從每年的接種效果還是可以看出不同品系間的抗性差異。從2009年第1次接種測(cè)定結(jié)果來(lái)看，馬尾松品系 A、G、I、L 的生存率100% ＞C、J、K 的83．3% ＞B、E、F 的66．7% ＞D、H的50%，第1發(fā)病時(shí)間最早的是品系H的37 d，最遲為品系C的57 d;2010年第2次接種測(cè)定結(jié)果為，馬尾松品系 A、G、I的生存率72．22% ＞L 的 66．67% ＞C、J、K 的58．82% ＞B、E、F 的56．25% ＞D、H的53．33%，第1發(fā)病時(shí)間最早的是品系H的31 d，最遲為品系G的52 d;而2011年第3次接種后，則全部表現(xiàn)健康，這可能與松材線蟲致病力下降、或溫濕度等環(huán)境脅迫因子有關(guān)。綜合3次接種測(cè)定效果，可以初步判定馬尾松品系A(chǔ)、G、I、L為抗病品系，D、H為感病品系，其它的為中抗(中感)品系。

表1 不同接種時(shí)間的馬尾松接種90 d后的生存率調(diào)查Table 1 Survival rate of Pinus massoniana of different inoculation time after 90 days

對(duì)3次接種測(cè)定結(jié)果進(jìn)行方差分析(表2)，結(jié)果表明3次測(cè)定效果存在極顯著差異，這可能與不同接種時(shí)間松材線蟲的致病力或不同齡級(jí)馬尾松的抗性有關(guān);而各品系間的測(cè)定結(jié)果存在顯著差異，說明各品系對(duì)松材線蟲的抗性有顯著差異。

對(duì)3次接種測(cè)定結(jié)果進(jìn)行Duncan多重比較，結(jié)果顯示馬尾松品系A(chǔ)、G、I、L與D、H間存在顯著差異，說明馬尾松品系A(chǔ)、G、I、L與D、H對(duì)松材線蟲的抗性有顯著差異。

表2 三次測(cè)定結(jié)果方差分析Table 2 The ANOVA results of three measurements

2．2 生長(zhǎng)性狀分析

對(duì)接種后的12個(gè)馬尾松品系進(jìn)行生長(zhǎng)性狀測(cè)定(表3)，結(jié)果表明長(zhǎng)勢(shì)最好的是品系G，長(zhǎng)勢(shì)最差的為F品系，二者間的生長(zhǎng)性狀存在極顯著差異。從地徑來(lái)看，馬尾松品系G＞E＞J＞L＞K＞A＞D＞H＞I＞C＞B＞F，除了G與F存在極顯著差異、G與C、B、F存在顯著差異、G、E與B、F存在顯著差異、G、E、J、L與F存在顯著差異外，其余均不顯著;從樹高來(lái)分析，G＞L＞K＞I＞J＞E＞A＞B＞H＞D＞C＞F，馬尾松品系G除與K、I、L間存在顯著差異外，與其它的品系存在極顯著差異，K、I、L與C、F間存在顯著差異，其余均不顯著，差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果說明了品系G的生長(zhǎng)性狀在12個(gè)品系中屬于一枝獨(dú)秀，表現(xiàn)出最優(yōu)良的生長(zhǎng)性狀，B、F、C屬于生長(zhǎng)最差的一類。

對(duì)12個(gè)馬尾松品系的生長(zhǎng)性狀進(jìn)行方差分析，從表4的分析結(jié)果顯示，不同品系間的生長(zhǎng)性狀存在極顯著、顯著差異，而各品系內(nèi)的生長(zhǎng)無(wú)顯著差異。

表3 各馬尾松品系生長(zhǎng)性狀調(diào)查(5年生)Table 3 Growth traits of different Pinus massoniana strains(5 year old)

表4 方差分析結(jié)果Table 4 The ANOVA results

用歐氏距離計(jì)算各品系之間的距離，采用離差平方和法，對(duì)12個(gè)馬尾松品系的生長(zhǎng)性狀進(jìn)行聚類分析，所得結(jié)果見圖1。根據(jù)聚類圖，取T=0．62，可將12個(gè)品系分為四類:

第一類:唯一的G，平均地徑最大，平均樹高最高;

第二類:I、A、D、H等4個(gè)品系，平均地徑和樹高生長(zhǎng)次之;

第三類:E、J、K、L等4個(gè)品系，長(zhǎng)勢(shì)較差;

第四類:B、C、F等3個(gè)品系，長(zhǎng)勢(shì)最差。

圖1 12個(gè)馬尾松品系的聚類Figure 1 The cluster analysis of 12 kinds of Pinus massoniana strains

3 小結(jié)與討論

馬尾松種源對(duì)松材線蟲抗性變異有明顯的地理趨勢(shì)。它與緯度顯著負(fù)相關(guān)，與經(jīng)度無(wú)關(guān)，是單一的南北向變異。同時(shí)，它與溫度和降水因子顯著或極顯著正相關(guān)。隨著產(chǎn)地從南至北，水熱條件由濕熱到干冷，抗性不斷減弱。抗性弱的種源主要分布在南帶。這個(gè)趨勢(shì)與馬尾松種源從西南至東北生長(zhǎng)量下降的趨勢(shì)基本一致，因此，對(duì)馬尾松種源從抗松材線蟲和生長(zhǎng)量?jī)蓚€(gè)方面進(jìn)行綜合選擇是可行的(汪企明等，1997)。

經(jīng)過3個(gè)年度連續(xù)接種試驗(yàn)，已取得初步成效，初步篩選出4個(gè)抗病品系(A、G、I、L)，2個(gè)感病品系(D、H)，其它的為中抗(中感)品系;結(jié)合12個(gè)馬尾松品系的生長(zhǎng)性狀，G、I、A、D、H等5個(gè)為生長(zhǎng)良好品系，綜合判定:A、G、I等3個(gè)品系既抗病又速生，可以進(jìn)行造林試驗(yàn)，通過進(jìn)一步測(cè)定后再進(jìn)行生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。課題組認(rèn)為選擇出的這些抗病品系只是獲得的初級(jí)成果，對(duì)這些抗性材料還必須經(jīng)過多次人工接種試驗(yàn)。不斷淘汰感病材料，最終獲得抗性穩(wěn)定的抗病種源和家系，以此為親本材料，建立抗病馬尾松種子園，為林業(yè)生產(chǎn)和造林綠化提供抗病良種。

高景斌，蔡衛(wèi)兵，徐六一，席啟俊，戶田忠雄．2005．接種用松材線蟲分離種群的篩選．林業(yè)科技開發(fā)，19(1):24-27．

焦國(guó)堯，沈培垠，李紅梅．1996．日本松材線蟲和南京松材線蟲對(duì)雪松和馬尾松的致病性研究．植物檢疫，(4):193-195．

唐啟義，馮明光．2002．實(shí)用統(tǒng)計(jì)分析及其DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)．北京:科技出版社．

汪企明，吳禮才，楊寶君，胡凱基，馮沛熙，許德玨，李永忠．1992．馬尾松抗松材線蟲病的驗(yàn)證及黑松感病進(jìn)程．森林病史通訊，(4):4-6．

汪企明，徐福元，葛明宏，王章榮，陳天華．1997．13年生馬尾松39個(gè)種源對(duì)松材線蟲抗性變異初步研究．浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，14(1):29-34．

王斐，申荷麗．2004．日本的抗松材線蟲育種研究．世界林業(yè)研究，17(6):44-46．

徐福元，葛明宏．1996．南京地區(qū)不同松種和馬尾松種源對(duì)松材線蟲病的抗性及病害流行規(guī)律．林業(yè)科學(xué)研究，9(5):521-524．

徐福元，葛明宏，汪企明，張培，朱克恭，趙菊林，胥東，王敏敏．1998．馬尾松種源對(duì)松材線蟲病的抗性．南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，22(2):29-33．

徐福元，席客，徐剛，周元生，許文力，徐克勤，葛明宏．1994．不同齡級(jí)馬尾松對(duì)松材線蟲病抗性的探討．南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，18(3):27-33．

楊寶君，胡凱基，王秋麗，孫玉林，吳政民，汪企明．1993．松樹對(duì)松材線蟲抗性的研究．林業(yè)科學(xué)研究，6(3):249-255．

楊寶君，王秋麗，鄒衛(wèi)東，李永才，于濤，王君明．1987．不同松樹品種對(duì)松材線蟲的抗性．植物病理學(xué)報(bào)，17(4):211-214．

Kurode K，Ito S．1992．Migration speed of pine nematodes and activities of other microbes during the development of pine-wilt disease in Pinus thunbergii．J．Jpn．For．Soc．，74(5):383-389．