湯陳生，黃金水，楊 希，洪永輝，何學(xué)友

(1．福建省林業(yè)科學(xué)研究院，福建福州350012;2．福建省漳平五一國有林場，福建漳平364400)

松材線蟲病在我國不斷猖獗危害，新的疫點時有發(fā)生，危害樹種由早期的黑松Pinus thunbergii轉(zhuǎn)移到現(xiàn)在以馬尾松P．massoniana為主(高景斌等，2005)。馬尾松是我國南方主要造林樹種，由于其具有耐瘠薄的生長特性，是一種非常好的生態(tài)造林先鋒樹種。對松材線蟲病的防治方法多種多樣，但往往受到人力和財力的影響，以及清理病害的困難、傳播擴散途徑的復(fù)雜性，很難獲得較好的控制效果。松材線蟲病日益威脅著我國南方地區(qū)的松樹安全;另外，化學(xué)防治污染環(huán)境，帶來新的次生性危害，造成更多的經(jīng)濟損失。盡管目前對于該病害防治仍在不斷開展，但一直未取得較好控制效果，尋找更為安全、有效的防治和控制方法十分迫切。所以，探索和開辟新的防治措施是一項非常重要的事情。馬尾松抗病品種的開發(fā)及運用，能夠阻止或極大程度上延緩該病的發(fā)生和危害，對生態(tài)和經(jīng)濟發(fā)展有著十分重大的意義。國內(nèi)外對松樹抗松材線蟲的特性已進行了不少研究(焦國堯等，1996;汪企明等，1992;王斐和申荷麗，2004;楊寶君等，1987，1993;徐福元等，1994，1998;徐福元和葛明宏，1996;Kurode and Ito，1992)，但報道結(jié)果不太一致。因此，從福建實際出發(fā)，擬通過人工接種，初步篩選出供生產(chǎn)上應(yīng)用的抗病品系，顯得尤為重要。

1 材料與方法

1．1 材料來源

1．1．1 供試馬尾松 供試馬尾松來源于福建省漳平五一國有林場，目前生產(chǎn)上推廣的12個馬尾松品系。這12個優(yōu)良家系原產(chǎn)地分布在南平(A、B)2個、三明(C、D、E、G、H)5個、龍巖(K、L)2個、漳州(F)1個、泉州(I、J)2個。3年生盆栽苗的平均地徑為2．678 cm，平均樹高為1．486 m。

1．1．2 供試松材線蟲

(1)松材線蟲準(zhǔn)備 2008年12月在廈門島內(nèi)當(dāng)年松材線蟲致死的枯死樹樣本中選取5 cm的木塊，按自來水洗凈→99．9%酒精液沖淋1遍→滅菌水洗3次→切碎→貝曼漏斗法分離→用螺口指形管離心的方法收集供試PWN蟲株，將供試PWN蟲株放在1．5%乳酸溶液中滅菌1 h后，再用滅菌水洗3次后備用。在超凈工作臺中將其分別接種到PDA培養(yǎng)基上生長良好的多毛孢菌絲中，放在恒溫培養(yǎng)箱中，在25℃溫度下初代培養(yǎng)。(具體的分離、培養(yǎng)技術(shù)詳見附件1已正式發(fā)表論文)。

(2)松材線蟲大量增殖 將玉米裝在三角瓶中用水浸泡24h，經(jīng)120℃、1．8大氣壓、間歇2次15 min滅菌，待冷卻后接種多毛孢;在25℃溫度下培養(yǎng)10 d后備用。從備用有松材線蟲增殖的PDA培養(yǎng)基中，切取0．5cm×0．5 cm的培養(yǎng)基切塊，接種在玉米培養(yǎng)基的菌絲上，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中，經(jīng)2周后，每個三角瓶的水中有大量松材線蟲，用貝曼漏斗法分離→離心→蒸溜水沖洗→貝曼漏斗收集(徐福元和葛明宏，1996)，反復(fù)收洗4～5次后，收集到大量松材線蟲備用。

1．2 試驗方法

1．2．1 接種方法 采用人工皮接法。用消毒解剖刀在松苗中偏下的莖干上割開樹皮，深達木質(zhì)部，作為接種傷口。掀開樹皮，塞入大小合適的滅菌棉球;再在傷口的下方扎一塑料薄膜袋，其呈倒圓錐體，口徑約7 cm，高約10 cm，袋底部及接口處用封口膜纏緊，確保不漏水;將樹皮(傷口)和棉球包圍其中。最后用微量移液器注入線蟲懸浮液，再加入適量的無菌水，以免線蟲因水分不足而死亡。對照組加入無菌水。接種后的第一天每2-3 h補充無菌水，保證24 h內(nèi)袋中有水。24 h后定期澆水，并適度控制水量，避免干旱脅迫或水分過多。

1．2．2 接種測定 2009年開始對3年生馬尾松盆栽苗進行第1次人工接種測定，接種量為8 000條/株，接種時間為9月10日，翌年2月將完全健康的植株全部集中，供二次接種使用。從第1次接種后病死的松苗體上分離松材線蟲，經(jīng)大量增殖后，于2010年5月12日進行2次接種，再從接種死亡的松苗分離線蟲并擴繁，于2011年4月18日進行第3次接種，接種方法同上。接種后每天觀察松苗的發(fā)病情況，統(tǒng)計發(fā)病級值，計算感病率、感病指數(shù)。統(tǒng)計接種后90 d的死亡率。

病株分級標(biāo)準(zhǔn):0級(不感病，針葉正常)。1，2，3級(病情輕，1/3針葉褪綠發(fā)暗;病情中等，l/3-1/2針葉發(fā)暗變黃;病情較重，1/2-3/4針葉枯黃)。4級(病情嚴(yán)重，3/4以上針葉枯黃，瀕死或死亡)(汪企明等，1997)。

感病指數(shù)=∑(各級株數(shù)×各級代表數(shù)值)/(調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最重級的代表數(shù)值)×100

1．2．3 生長性狀測定 于2009、2010、2011年的11月分別測定各馬尾松品系的地徑、樹高值，調(diào)查死亡率和天牛取食情況，對枯死苗木及時開展松材線蟲分離鑒定，確定其死亡原因。

1．2．4 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)整理與分析均采用Excel、DPS等軟件進行處理(唐啟義和馮明光，2002)。

2 結(jié)果與分析

2．1 馬尾松抗病品系的篩選

2009-2011年以8 000條/株的接線量進行三次接種后，每天調(diào)查各馬尾松品系的感病情況，根據(jù)病株分級標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計發(fā)病級值，計算出感病指數(shù)，90 d后統(tǒng)計各品系的生存率。結(jié)果(表1)顯示，3次接種測定90 d后的馬尾松生存率不盡相同，也沒有顯著的正負(fù)相關(guān)關(guān)系，但是單一從每年的接種效果還是可以看出不同品系間的抗性差異。從2009年第1次接種測定結(jié)果來看，馬尾松品系 A、G、I、L 的生存率100% ＞C、J、K 的83．3% ＞B、E、F 的66．7% ＞D、H的50%，第1發(fā)病時間最早的是品系H的37 d，最遲為品系C的57 d;2010年第2次接種測定結(jié)果為，馬尾松品系 A、G、I的生存率72．22% ＞L 的 66．67% ＞C、J、K 的58．82% ＞B、E、F 的56．25% ＞D、H的53．33%，第1發(fā)病時間最早的是品系H的31 d，最遲為品系G的52 d;而2011年第3次接種后，則全部表現(xiàn)健康，這可能與松材線蟲致病力下降、或溫濕度等環(huán)境脅迫因子有關(guān)。綜合3次接種測定效果，可以初步判定馬尾松品系A(chǔ)、G、I、L為抗病品系，D、H為感病品系，其它的為中抗(中感)品系。

表1 不同接種時間的馬尾松接種90 d后的生存率調(diào)查Table 1 Survival rate of Pinus massoniana of different inoculation time after 90 days

對3次接種測定結(jié)果進行方差分析(表2)，結(jié)果表明3次測定效果存在極顯著差異，這可能與不同接種時間松材線蟲的致病力或不同齡級馬尾松的抗性有關(guān);而各品系間的測定結(jié)果存在顯著差異，說明各品系對松材線蟲的抗性有顯著差異。

對3次接種測定結(jié)果進行Duncan多重比較，結(jié)果顯示馬尾松品系A(chǔ)、G、I、L與D、H間存在顯著差異，說明馬尾松品系A(chǔ)、G、I、L與D、H對松材線蟲的抗性有顯著差異。

表2 三次測定結(jié)果方差分析Table 2 The ANOVA results of three measurements

2．2 生長性狀分析

對接種后的12個馬尾松品系進行生長性狀測定(表3)，結(jié)果表明長勢最好的是品系G，長勢最差的為F品系，二者間的生長性狀存在極顯著差異。從地徑來看，馬尾松品系G＞E＞J＞L＞K＞A＞D＞H＞I＞C＞B＞F，除了G與F存在極顯著差異、G與C、B、F存在顯著差異、G、E與B、F存在顯著差異、G、E、J、L與F存在顯著差異外，其余均不顯著;從樹高來分析，G＞L＞K＞I＞J＞E＞A＞B＞H＞D＞C＞F，馬尾松品系G除與K、I、L間存在顯著差異外，與其它的品系存在極顯著差異，K、I、L與C、F間存在顯著差異，其余均不顯著，差異顯著性檢驗結(jié)果說明了品系G的生長性狀在12個品系中屬于一枝獨秀，表現(xiàn)出最優(yōu)良的生長性狀，B、F、C屬于生長最差的一類。

對12個馬尾松品系的生長性狀進行方差分析，從表4的分析結(jié)果顯示，不同品系間的生長性狀存在極顯著、顯著差異，而各品系內(nèi)的生長無顯著差異。

表3 各馬尾松品系生長性狀調(diào)查(5年生)Table 3 Growth traits of different Pinus massoniana strains(5 year old)

表4 方差分析結(jié)果Table 4 The ANOVA results

用歐氏距離計算各品系之間的距離，采用離差平方和法，對12個馬尾松品系的生長性狀進行聚類分析，所得結(jié)果見圖1。根據(jù)聚類圖，取T=0．62，可將12個品系分為四類:

第一類:唯一的G，平均地徑最大，平均樹高最高;

第二類:I、A、D、H等4個品系，平均地徑和樹高生長次之;

第三類:E、J、K、L等4個品系，長勢較差;

第四類:B、C、F等3個品系，長勢最差。

圖1 12個馬尾松品系的聚類Figure 1 The cluster analysis of 12 kinds of Pinus massoniana strains

3 小結(jié)與討論

馬尾松種源對松材線蟲抗性變異有明顯的地理趨勢。它與緯度顯著負(fù)相關(guān)，與經(jīng)度無關(guān)，是單一的南北向變異。同時，它與溫度和降水因子顯著或極顯著正相關(guān)。隨著產(chǎn)地從南至北，水熱條件由濕熱到干冷，抗性不斷減弱?？剐匀醯姆N源主要分布在南帶。這個趨勢與馬尾松種源從西南至東北生長量下降的趨勢基本一致，因此，對馬尾松種源從抗松材線蟲和生長量兩個方面進行綜合選擇是可行的(汪企明等，1997)。

經(jīng)過3個年度連續(xù)接種試驗，已取得初步成效，初步篩選出4個抗病品系(A、G、I、L)，2個感病品系(D、H)，其它的為中抗(中感)品系;結(jié)合12個馬尾松品系的生長性狀，G、I、A、D、H等5個為生長良好品系，綜合判定:A、G、I等3個品系既抗病又速生，可以進行造林試驗，通過進一步測定后再進行生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。課題組認(rèn)為選擇出的這些抗病品系只是獲得的初級成果，對這些抗性材料還必須經(jīng)過多次人工接種試驗。不斷淘汰感病材料，最終獲得抗性穩(wěn)定的抗病種源和家系，以此為親本材料，建立抗病馬尾松種子園，為林業(yè)生產(chǎn)和造林綠化提供抗病良種。

高景斌，蔡衛(wèi)兵，徐六一，席啟俊，戶田忠雄．2005．接種用松材線蟲分離種群的篩選．林業(yè)科技開發(fā)，19(1):24-27．

焦國堯，沈培垠，李紅梅．1996．日本松材線蟲和南京松材線蟲對雪松和馬尾松的致病性研究．植物檢疫，(4):193-195．

唐啟義，馮明光．2002．實用統(tǒng)計分析及其DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)．北京:科技出版社．

汪企明，吳禮才，楊寶君，胡凱基，馮沛熙，許德玨，李永忠．1992．馬尾松抗松材線蟲病的驗證及黑松感病進程．森林病史通訊，(4):4-6．

汪企明，徐福元，葛明宏，王章榮，陳天華．1997．13年生馬尾松39個種源對松材線蟲抗性變異初步研究．浙江林學(xué)院學(xué)報，14(1):29-34．

王斐，申荷麗．2004．日本的抗松材線蟲育種研究．世界林業(yè)研究，17(6):44-46．

徐福元，葛明宏．1996．南京地區(qū)不同松種和馬尾松種源對松材線蟲病的抗性及病害流行規(guī)律．林業(yè)科學(xué)研究，9(5):521-524．

徐福元，葛明宏，汪企明，張培，朱克恭，趙菊林，胥東，王敏敏．1998．馬尾松種源對松材線蟲病的抗性．南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，22(2):29-33．

徐福元，席客，徐剛，周元生，許文力，徐克勤，葛明宏．1994．不同齡級馬尾松對松材線蟲病抗性的探討．南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，18(3):27-33．

楊寶君，胡凱基，王秋麗，孫玉林，吳政民，汪企明．1993．松樹對松材線蟲抗性的研究．林業(yè)科學(xué)研究，6(3):249-255．

楊寶君，王秋麗，鄒衛(wèi)東，李永才，于濤，王君明．1987．不同松樹品種對松材線蟲的抗性．植物病理學(xué)報，17(4):211-214．

Kurode K，Ito S．1992．Migration speed of pine nematodes and activities of other microbes during the development of pine-wilt disease in Pinus thunbergii．J．Jpn．For．Soc．，74(5):383-389．