張鳳瑞,周 賢,劉 炎,翁麗麗,王淑敏＊,韓雪華

(1.長春中醫(yī)藥大學,吉林 長春 130117;2.延邊大學,吉林延吉133000)

當歸補血湯系中醫(yī)經(jīng)典名方,始載于李東垣的《內外傷辨惑論》,按黃芪∶當歸(5∶1)組成,具補氣生血等功效,多用于治勞倦內傷,氣血虛,陽浮于外之虛熱證。現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)其具有促進造血、調節(jié)免疫功能、保護心腦血管等作用。本文以黃芪及其所含的黃芪甲苷成分為定性和定量指標進行薄層鑒別和含量測定,建立本品的質量控制標準。

1 儀器與試藥

Waters 600液相色譜分離系統(tǒng),Agilent 1100自動進樣器,Alltech ELSD-2000蒸發(fā)光散射檢測器。黃芪藥材為膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.當歸藥材為當歸Angelica sinensis(Oliv.)Diel.購于長春市仙草藥材有限公司;乙腈為美國Fischer公司生產(chǎn),色譜醇;其它試劑為分析純;Milli-Q超純水。黃芪甲苷對照品(批號0781-200210,供含量測定用)購自中國藥品生物制品檢定所。

2 方法與結果

2.1 當歸補血湯供試品制備 取當歸飲片10 g,黃芪飲片50 g合煎,分別加入8、6倍水,煎煮2次,每次1 h,合并煎液,濾過,烘干,得浸膏。取1 g浸膏,加蒸餾水20 mL溶解,用水飽和正丁醇萃取 4次,每次40 mL,合并正丁醇液,蒸干,用甲醇定容到5 mL。用0.45 μ mol濾膜濾過,取續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.2 黃芪對照藥材供試品制備 取黃芪對照藥材50 g,分別加入 8、6倍水 ,煎煮2次 ,每次1 h,合并煎液,濾過,烘干,得浸膏。取1 g浸膏,同2.1中方法制備黃芪對照藥材供試品溶液。

2.3 黃芪陰性對照供試品制備 取當歸對照藥材50 g,分別加入 8、6倍水 ,煎煮2次 ,每次1 h,合并煎液,濾過,烘干,得浸膏。取1 g浸膏,同2.1中方法制備陰性對照藥材供試品溶液。

2.4 黃芪甲苷對照品制備 精密稱取黃芪甲苷標準品,加甲醇配成1.01 mg/mL的溶液,即得。

2.5 色譜條件 色譜柱:Diamonsil ODS-C18(5 μ,250 mm×4.6 mm)分析柱;流動相:乙腈-水(32∶68);流速:0.6 mL/min;柱溫:35℃;載氣流速:

2.7 mL/min;ELSD檢測器漂移管溫度:100℃;進樣量20 μ L 。

2.6 黃芪薄層色譜鑒別 取當歸補血湯浸膏1 g,加甲醇20 mL,加熱回流1 h,濾過,濾液加于中性氧化鋁柱(100～120目,5g,內徑為10～15mm)上,用40%甲醇100mL洗脫,收集洗脫液,蒸干,殘渣加水30mL使溶解,用水飽和的正丁醇振搖提取 2次,每次20 mL,合并正丁醇液,用水洗滌 2次,每次20 mL,棄去水液,正丁醇液蒸干,殘渣加甲醇0.5 mL使溶解,作為供試品溶液。另取當歸對照藥材浸膏1 g,同法制成對照藥材溶液。另取黃芪甲苷對照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗,吸取上述3種溶液和甲醇空白對照溶液各2 μ L,分別點于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加熱至斑點顯色清晰。日光下檢視,供試品、對照藥材、黃芪甲苷在相同的位置具有相同的斑點。見圖1。

圖1 黃芪薄層色譜鑒別

2.7 黃芪甲苷含量測定[1-3]

2.7.1 方法學考察

2.7.1.1 線性關系考察 取黃芪甲苷對照品溶液(1.01 mg/mL),分 別進 樣 1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μ L,記錄峰面積 ,以黃芪甲苷進樣量(μ g)的常用對數(shù)為橫坐標,峰面積的常用對數(shù)為縱坐標,繪制標準曲線,其回歸方程為:lgY=4 816 28lgX+317 832,r=0.999 7。結果表明,黃芪甲苷在1.01～20.2 μ g范圍內線性關系良好。

2.7.1.2 精密度試驗 取同一對照品溶液,進樣10 μ L,重復進樣 5次,測定峰面積積分值分別為5 044 367,5 001 365,5 033 698,5 019 963,5 009 430,RSD=0.35%,精密度較好。

2.7.1.3 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液,定時(1,2,4,8,12 h)進行測定,進樣各 20 μ L,測定峰面積積分值分別為,5 054 367,4 892 365,4 903 698,5 049 963,5 009 430,RSD=1.6%,穩(wěn)定性較好。

2.7.1.4 重復性試驗 精密稱定樣品3份,按照2.1項下方法制備樣品溶液,計算含量測定結果分別為1.512,1.451 2,1.389 8,1.447 7,1.448 5 mg/g,RSD=2.98%,重復性良好。

2.7.1.5 回收率試驗 精密稱定已知黃芪甲苷含量為1.448 5 mg/g的樣品3份,每份各 1.0 g,分別精密加入黃芪甲苷對照品溶液(1.01 mg/mL)1 mL,按照“2.1”項下方法制備樣品溶液,計算含量測定結果分別為2.437 3,2.371 6,2.431 2,2.472 4,2.389 2 mg/g,平均回收率為95.04%,RSD=1.66%。

2.7.2 樣品測定 取3批當歸補血湯藥材,按“2.1”項下方法制備供試品溶液,按“2.5”項下色譜條件進樣測定,根據(jù)黃芪甲苷的線性回歸方程,計算黃芪甲苷含量,結果當歸補血湯分別為1.448 5,1.443 6,1.451 2 mg/g,均值為1.447 8 mg/g。

3 小結

采用薄層色譜鑒別黃芪專屬性好,高效液相色譜檢測黃芪甲苷在1.01～20.2 μ g范圍內呈良好的線性關系,平均加樣回收率為95.04%,RSD=0.61%。所建立方法簡便、準確,快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好,可用于當歸補血湯的質量控制。

[1]王寶,蘇健,魯靜.黃芪甲甙的檢測在中藥質控中的應用[J].中國中藥雜志,1996,21(3):161.

[2]俞家華,曹正中,張勤.膜莢黃芪中黃芪甲苷的含量測定[J].中藥通報,1986,11(9):38.

[3]肖紅,于淼.北芪精口服液中黃芪甲苷的測定[J].長春中醫(yī)學院學報,2003,19(4):49.