黃 銳，劉 敏，熊克仁

(皖南醫(yī)學院 解剖學教研室，安徽 蕪湖 241002)

在我國分布著各類毒蛇，眼鏡蛇就是其中的一種，對人生命造成一定的威脅。眼鏡蛇毒是由眼鏡蛇毒腺分泌的一種毒蛋白，化學成分復雜，具有多種毒理和藥理效應。TRN是位于丘腦前外側(cè)面的一個核團，與感覺、運動和邊緣系統(tǒng)等活動密切相關(guān)［1］。c-fos基因?qū)儆诩纯淘缙诨?，參與細胞的生長、繁殖、分化、信息傳導、學習以及記憶等功能［2］。我室曾報道眼鏡蛇毒對TRN c-fos的表達有上調(diào)作用［3］。c-jun基因也屬于即刻早期基因家族，與c-fos關(guān)系密切［4］。c-jun在眼鏡蛇毒作用下表達如何，尚未見報道。本實驗旨在探討眼鏡蛇毒對大鼠TRN c-jun表達的影響，為探討眼鏡蛇毒中毒機制提供相關(guān)的形態(tài)學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蛇毒 眼鏡蛇毒(干毒)，由安徽黃山市屯溪毒蛇養(yǎng)殖研究所提供。

1.2 實驗動物及分組 實驗用SD大鼠18只，由皖南醫(yī)學院動物中心提供，雌雄不拘，體質(zhì)量230～270 g。隨機分為正常組、生理鹽水組和眼鏡蛇毒組，每組6只。

1.3 實驗方法 眼鏡蛇毒組大鼠右后肢常規(guī)消毒后，將生理鹽水與干粉狀眼鏡蛇毒按3∶1比例稀釋，于大鼠右后肢下部按0.5 μl/kg肌肉注射;生理鹽水組于同一部位注入等量生理鹽水;正常對照組大鼠不作任何處理。觀察30 min，待蛇毒組大鼠出現(xiàn)毛發(fā)豎立、焦躁、嗆咳、呼吸急促伴哮鳴音或濕性啰音等明顯中毒癥狀時，將3組大鼠同時處死，用100 ml生理鹽水和300 ml 4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定，取大鼠腦TRN節(jié)段在4%多聚甲醛固定液中于4℃冰箱固定24 h后取出，流水沖洗30 min，酒精梯度脫水，二甲苯透明及浸蠟，包埋制成蠟塊。石蠟切片，片厚5 μm，切片入二甲苯脫蠟、梯度酒精復水，依次進入下列各步驟:3%H2O2室溫(24～28℃)封閉7 min，在0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中行微波修復，自然冷卻，滴加正常山羊血清封閉液在恒溫箱中孵育 1h，不洗，滴加 c-jun抗體(1∶1 200)，4℃冰箱過夜。第2天取出，于恒溫箱中復溫1 h，滴加生物素化羊抗兔IgG于恒溫箱中2 h，滴加鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)液于恒溫箱中1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。恒溫箱溫度均設(shè)定在37℃。最后經(jīng)酒精脫水和二甲苯透明后行中性樹膠封片，晾干，光鏡下觀察。

1.4 細胞計數(shù)及圖像處理 每組選取相同部位切片進行觀察，以王平宇的大鼠腦切片圖譜為參照，采用黑馬病理圖像分析系統(tǒng)進行細胞計數(shù)及平均灰度值測量。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間采用F檢驗，組間兩兩比較采用q檢驗，以α=0.05作為檢驗水準，P＜0.05作為判定有統(tǒng)計學意義的依據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 眼鏡蛇毒對TRN c-jun陽性細胞數(shù)和平均灰度值的影響 正常組、生理鹽水組和眼鏡蛇毒組大鼠TRN均可見c-jun陽性細胞。c-jun陽性細胞呈棕黃色，主要為胞漿著色，著色較均勻。生理鹽水組與正常組大鼠TRN c-jun陽性細胞數(shù)量及平均灰度值相比較無明顯改變(P＞0.05);眼鏡蛇毒組大鼠TRN c-jun陽性細胞數(shù)量及表達強度與生理鹽水組和正常組相比均顯著增高(P＜0.01)，平均灰度值顯著降低(P＜0.01)。結(jié)果見表1、圖1和圖2。

表1 各組大鼠TRN c-jun陽性細胞數(shù)及平均灰度值(±s，n=6)Tab 1 The number of c-jun positive cells and the average gray value in TRN for each group of rats(±s，n=6)

表1 各組大鼠TRN c-jun陽性細胞數(shù)及平均灰度值(±s，n=6)Tab 1 The number of c-jun positive cells and the average gray value in TRN for each group of rats(±s，n=6)

注:兩兩比較采用q檢驗，兩組間字母不同P＜0.05，字母相同P ＞0.05

組別 細胞數(shù)(個/10×40倍視野)平均灰度值正常組 24.60 ±2.46a 127.27 ±5.51a 0.000 0.000生理鹽水組 22.80 ±2.39a 132.30 ±2.18a眼鏡蛇毒組 43.60 ±2.32b 103.90 ±8.72b F 值 139.43 37.19 P值

2.2 眼鏡蛇毒對TRN不同形態(tài)c-jun陽性細胞的影響 三組大鼠TRN均可見圓形、橢圓形、梭形及三角形等多種形態(tài)的c-jun陽性細胞。生理鹽水組細胞形態(tài)與正常組相比無明顯改變(P＞0.05);眼鏡蛇毒組圓形、橢圓形、梭形細胞數(shù)量比生理鹽水組及正常組明顯增多(P＜0.01)，三角形細胞數(shù)量無明顯改變(P＞0.05)。結(jié)果見表2、圖1和圖2。

表2 各組大鼠TRN c-jun陽性細胞形態(tài)(±s，n=6)Tab 2Morphology of c-jun positive cells in TRN for each group of rats(±s，n=6)

表2 各組大鼠TRN c-jun陽性細胞形態(tài)(±s，n=6)Tab 2Morphology of c-jun positive cells in TRN for each group of rats(±s，n=6)

注:兩兩比較采用q檢驗，兩組間字母不同P＜0.05，字母相同P＞0.05

0.000 0.000 0.000 0.562 3.60 ±0.70生理鹽水組 7.30 ±0.82a 6.40 ±0.70a 5.50 ±0.53a 3.50 ±0.97眼鏡蛇毒組 15.00 ±0.67b 13.00 ±0.82b 11.60 ±0.70b 4.00 ±0.82 F 值 181.94 121.93 177.23 0.60 P值組別 圓形 橢圓形 梭形 三角形正常組 8.00 ±0.82a 7.40 ±0.84a 5.70 ±0.67a

圖1 大鼠TRN c-jun陽性細胞(免疫組織化學染色法，×200)A:正常組;B:生理鹽水組;C:眼鏡蛇毒組Fig 1 C-jun positive cells in TRN of rats(Immunohistochemistry technique，×200)A:control group;B:saline group;C:N.atra venom group

圖2 大鼠TRN c-jun陽性細胞(免疫組織化學染色法，×400)A:正常組;B:生理鹽水組;C:眼鏡蛇毒組Fig 2 C-jun positive cells in TRN of rats(Immunohistochemistry technique，×400)A:control group;B:saline group;C:N.atra venom group

3 討論

眼鏡蛇毒中含有神經(jīng)毒素和細胞毒素，可導致細胞溶解、神經(jīng)細胞信息傳導阻滯，從而影響神經(jīng)細胞的正常功能。即刻早基因普遍存在于中樞神經(jīng)細胞中，在生理情況下少表達;在病理情況下，如疼痛、腦缺血、癲癇、電刺激等傷害性刺激情況下可致cjun在腦相關(guān)區(qū)域中呈一過性、廣泛、快速的表達［5］。c-jun參與c-fos對靶基因的調(diào)控過程，在神經(jīng)細胞信息傳導中起著重要作用。當神經(jīng)細胞受到外界刺激后，興奮性氨基酸或NMDA受體等第一信使被激活，導致CaM、Ca2+、IP3、cAMP等第二信使進入細胞核，進而快速誘導c-jun和c-fos轉(zhuǎn)錄，使其細胞漿中的mRNA數(shù)量快速增加，翻譯出的Fos和Jun蛋白進入胞核內(nèi)并形成異源二聚體Fos-Jun復合物，與基因中的AP-1調(diào)節(jié)位點緊密結(jié)合，從而進一步激活靶基因，使神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)與功能在較長時間內(nèi)出現(xiàn)改變［6－7］。當神經(jīng)細胞受到傷害性刺激時，可導致cjun基因的表達改變。有研究表明在周圍或中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后，神經(jīng)細胞出現(xiàn)再生反應，并伴隨c-jun基因表達增強，提示c-jun在抑制神經(jīng)細胞凋亡、促進受損細胞修復以及改善神經(jīng)細胞的存活方面發(fā)揮著極為重要的作用［8－9］。因此，本實驗觀察到眼鏡蛇毒組TRN c-jun陽性細胞的增多，推測cjun可能有助于減少蛇毒對神經(jīng)細胞造成的損傷，保護和修復部分受損的神經(jīng)細胞，完善神經(jīng)細胞的結(jié)構(gòu)和功能。本實驗同時在高倍視野下觀察到TRN主要以圓形、橢圓形和梭形c-jun陽性細胞者居多，眼鏡蛇毒組上述三種形態(tài)的c-jun陽性細胞數(shù)明顯增加，提示眼鏡蛇毒主要對大鼠TRN圓形、橢圓形和梭形的c-jun陽性細胞表達有影響，其機理尚待進一步研究。

TRN是位于內(nèi)囊和外髓板兩者之間的一薄層神經(jīng)細胞，它接受來自板內(nèi)核群和大腦皮質(zhì)投射來的纖維，并發(fā)出纖維至丘腦各核團，繼而再投射至大腦皮質(zhì)，形成丘腦-皮質(zhì)環(huán)路。有報道表明c-fos、c-jun基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)與痛覺傳導密切相關(guān)［10］。本室曾報道眼鏡蛇毒可使延髓中神經(jīng)元型一氧化氮合酶陽性神經(jīng)元表達增強［11］。注射眼鏡蛇毒對大鼠是一種傷害性刺激，在傷害性刺激條件下，一氧化氮(NO)可誘導c-fos基因的快速表達［12］，而c-jun和c-fos的表達是偶聯(lián)的，c-fos基因產(chǎn)物Fos蛋白必須與c-jun轉(zhuǎn)錄mRNA編碼的Jun蛋白結(jié)合，才能發(fā)揮其生物學作用［13］。本實驗觀察到在注射眼鏡蛇毒后大鼠TRN c-jun陽性細胞數(shù)明顯增多，提示可能通過NO作為第二信使，介導c-fos、c-jun基因的表達，從而在傷害性信息的傳導過程中發(fā)揮重要作用，而TRN是否作為傷害性信息傳向大腦皮質(zhì)通路中的中繼性核團，還有待深入研究。

［1］PINAULT D.The thalamic reticular nucleus:structure，function and concept［J］.Brain Res Rev，2004，46(1):1 －31.

［2］黃勁柏，卓廉佳，劉龍浩，等.急救穴刺血對實驗性腦缺血大鼠大腦皮層、海馬區(qū)c-fos mRNA表達的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2012，21(4):582 －584.

［3］王麗發(fā)，徐臣利，熊克仁.眼鏡蛇毒對大鼠丘腦網(wǎng)狀核c-fos表達的影響［J］.蛇志，2010，22(1):9 －11.

［4］LAURA A，F(xiàn)RACZEK，CAROL B，et al.c-Jun and c-Fos regulate the complement factor H promoter in murine astrocytes［J］.Molecular Immunology，2011，49:201 －210.

［5］HIROYUKI ICHIKAWA，MITSUHIRO KANO，YOSHINAKA SHI MIZU，et al.Increase of c-Fos and c-Jun Expression in Spinal and Cranial Motoneurons of the Degenerating Muscle Mouse(Scn8admu)［J］.Cellular and Molecular Neurobiology，2010，30:737－742.

［6］MIYAMOTO E.Molecular mechanism of neuronal plasticity:induction and maintenance of long-term potentiation in the hippocampus［J］.Pharmacol Sci，2006，100:433 － 442.

［7］KUBIK S，MIYASHITA T，GUZOWSKI JF.Using immediate-early genes to map hippocampal subregional functions［J］.Learning and Memory，2007，14:758 －770.

［8］ZHOU LH，HAN S，XIE YY，et al.Differences in c-jun and nNOS expression levels in motoneurons following different kinds of axonal injury in adult rats［J］.Brain Cell Biology，2008，36:213 －227.

［9］M.O.SAMOILOV，E.A.RYBNIKOVA，N.A.SITNIK，et al.Preconditioning modifies the activities of mitogen-activated protein kinases and c-Jun transcription factor in rat hippocampus after severe hypobaric hypoxia［J］.Neurochemical Journal，2007，1:219 －226.

［10］劉斌，符艷松，王彩霞.頭痛寧膠囊對偏頭痛模型大鼠中腦和下丘腦c-fos，c-jun基因表達的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17(11):195 －198.

［11］倪進忠，龔鑫，熊克仁.眼鏡蛇毒對大鼠延髓nNOS表達的影響［J］.蛇志，2008，20(3):169 －176.

［12］趙永烈，王玉來，高穎.芍芷地龍湯對偏頭痛模型中腦導水管周圍灰質(zhì)c-fos和NOS蛋白共存表達的影響［J］.環(huán)球中醫(yī)藥，2009，2(4):269 －272.

［13］王寶見，鐘華，張國英，等.腦痛立停膠囊對偏頭痛模型大鼠腦干及下丘腦c-fos、c-jun基因表達的影響［J］.新中醫(yī)，2009，41(2):104－106.