秦 莉，程文杰，王軍揚(yáng)，潘曉亮*

(1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)九師170團(tuán)，新疆 塔城 834615)

沙棘(Hippophaerhamnoides)，別名酸刺、醋柳，屬胡頹子科落葉灌木或小喬木，喜光照，是一種藥食兼用的多年生植株。廣泛分布于我國(guó)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010年中國(guó)有沙棘林140×104hm2，占世界沙棘總面積的90%以上。其中“三北”地區(qū)有117×104hm2，占全國(guó)總面積的84%[1]。隨著新疆自治區(qū)以防風(fēng)固沙為主的退耕還林、還草工程的實(shí)施，沙棘將在這項(xiàng)工程中發(fā)揮巨大作用，種植面積將逐年增加。

黃酮類化合物是一類在植物界廣泛存在的多酚類天然產(chǎn)物。從沙棘果和葉中提取的總黃酮具有抗心肌缺血、降低血清膽固醇、抑制血小板聚集、具有抵御紫外線、抗輻射、抗腫瘤、抗氧化、抗艾滋病毒(HIV)和增強(qiáng)免疫力等廣泛的藥理作用[2-4]。

沙棘含有豐富的黃酮類化合物，具有抗氧化和清除自由基；抗腫瘤、抗癌癥；抗菌抗病毒；抗炎免疫等功效[5]。施榮富等[6]相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，沙棘葉中含有豐富的黃酮類化合物成分，并且與沙棘果中的成分不相同。異鼠李素和槲皮素主要分布在沙棘果中，并且所占比例約為70%，而葉中除了異鼠李素、槲皮素之外，還有含量比較高的山奈酚。品種不同，葉中所含的黃酮類化合物種類的含量分布也不同，如中國(guó)沙棘中，山奈酚、異鼠李素、槲皮素三者所占總含量的比例非常相近。沙棘果實(shí)中黃酮含量為309～945 mg/100 g，而葉中黃酮的含量高于果實(shí)，為310～1 238 mg/100g[7]。目前沙棘黃酮類化合物的研究主要集中于果實(shí)、果渣、果皮及葉四種材料，除此之外的地上部分多是被廢棄處置，未被利用，因此對(duì)沙棘其他部位黃酮含量的測(cè)定進(jìn)行研究具有必要性。本文通過(guò)超聲波技術(shù)對(duì)不同品種同一部位及同一品種不同部位的沙棘枝葉進(jìn)行黃酮類化合物的提取，采用紫外分光光度法測(cè)定其總黃酮的含量，以期為人們進(jìn)一步利用沙棘資源提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原料 小果沙棘、中果沙棘、大果沙棘、雄性沙棘4個(gè)品種的沙棘葉、小枝(0

1.1.2 主要儀器及試劑 UV-1 100 LabTech紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)，KQ-50R型超聲波提取器(昆山市超聲儀器有限公司)，萬(wàn)分之一電子天平，臺(tái)式高速離心機(jī)。

蘆丁(Rutin)標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于98%，批號(hào)：090708)購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；甲醇、氫氧化鉀、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇均為分析純；試驗(yàn)過(guò)程中使用的水均為雙蒸水。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用紫外分光光度法(NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法)測(cè)定總黃酮含量。NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法是普遍用于測(cè)定中藥材、成方制劑中總黃酮類化合物含量的方法[8]。其原理是NaNO2先將黃酮類化合物還原，鋁離子與黃酮類化合物在堿性條件下生成紅色絡(luò)合物，紅色絡(luò)合物在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有光吸收，通過(guò)測(cè)定其吸光度從而確定總黃酮的含量[9]。

1.2.1 沙棘枝葉的預(yù)處理 4個(gè)品種的沙棘葉、小枝、中枝、大桿及其混合株65 ℃烘至恒重，粉碎，過(guò)60目篩，密封，備用。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 稱取105 ℃下干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品0.1 g于100 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得蘆丁對(duì)照品溶液，濃度為1 mg/mL。

1.2.3 總黃酮的提取 總黃酮的提取參考馮薇等[10]方法略有改動(dòng)。精密稱取樣品粉末0.2 g，置于10 mL離心管中，加入5 mL甲醇，稱重，超聲提取70 min，然后5 000 r/min離心15 min，上清液即為總黃酮提取液，備測(cè)。每個(gè)樣品重復(fù)提取3次。

1.2.4 最大吸收波長(zhǎng)的選擇 取對(duì)照品溶液1.0 mL于25 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，以甲醇作空白對(duì)照，在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外可見(jiàn)掃描，結(jié)果顯示，蘆丁溶液在460 nm處具有最佳吸收峰，故選擇460 nm作為吸收波長(zhǎng)。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL于25 mL 容量瓶中，分別加1%NaNO2溶液3 mL，搖勻，靜置6 min，加1%Al(NO3)3溶液3 mL，搖勻，靜置6 min，加1%NaOH溶液4 mL，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，得對(duì)照品待測(cè)液。以相應(yīng)溶液做空白，在460 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度。以吸光度(A)做y軸，以濃度(C)做x軸，獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=11.031x-0.0379，R2=0.9983，如圖1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard Rutin solution curve of concentration-absorbance

1.2.6 方法學(xué)考察 分別精確量取0.75 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液液5份，按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，測(cè)定吸光度值，分析可得SD為0.1673%，RSD為0.6%，所測(cè)結(jié)果較小，表明試驗(yàn)重復(fù)性比較好，所測(cè)數(shù)據(jù)較準(zhǔn)確。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of repetition of the standard Rutin solution

1.2.7 樣品黃酮含量的測(cè)定 精確吸取樣品提取液250 μL，置于10 mL離心管中，分別加1%NaNO2溶液0.6 mL，搖勻，靜置6 min，加1%Al(NO3)3溶溶液0.6 mL，搖勻，靜置6 min，加1%NaOH溶液2.0 mL，加60%乙醇稀釋至5 mL，搖勻，靜置15 min，在460 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用Excel數(shù)據(jù)，后采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 同一品種不同部位總黃酮含量的比較

由表2可知，小果沙棘、中果沙棘、大果沙棘不同部位總黃酮含量均以枝葉混合的最高，依次為(9.3009±0.1672) mg/g、(10.3175±0.0103) mg/g、(11.3093±0.2701) mg/g；其次為葉，依次為：(8.3750±0.1108) mg/g、(9.5835±0.0123) mg/g、(11.0546±0.0572) mg/g；大桿的含量最低，依次為：(5.0520±0.012) mg/g、(5.4330±0.012) mg/g、(6.9774±0.3275) mg/g。

由表2知，小果沙棘除小枝和中枝總黃酮含量差異不顯著外(P>0.05)，其他部位之間總黃酮含量均具有顯著性差異(P<0.05)。中果沙棘中將葉、小枝、中枝、枝葉混合四個(gè)不同部分進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示，均差異不顯著(P>0.05)。但將大桿與其他四部分進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示，均具有顯著性差異(P<0.05)。大果沙棘中將大果的葉與枝葉進(jìn)行兩兩比較，兩者差異不顯著(P>0.05)；小枝與中枝兩兩比較，也差異不顯著(P>0.05)；除此之外其他部位進(jìn)行兩兩比較均具有顯著性差異(P<0.05)。雄性沙棘中將其葉與枝葉混合兩部分進(jìn)行比較，結(jié)果顯示兩者差異不顯著(P>0.05)；中枝、大桿兩部分進(jìn)行比較，結(jié)果顯示差異不著(P>0.05)；除此之外其他部位進(jìn)行兩兩比較均具有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 不同品種同一部位總黃酮含量的比較

由表2可知，不同品種同一部位總黃酮含量有所不同。葉所含總黃酮含量大小依次為：雄性沙棘>大果沙棘>中果沙棘>小果沙棘。除大果和雄性比較差異不顯外(P>0.05)，其他部位之間進(jìn)行比較均具有顯著性差異(P<0.05)；小枝所含黃酮含量大小依次為中果沙棘>雄性沙棘>大果沙棘>小果沙棘，其中中果沙棘與雄性沙棘比較差異不顯著(P>0.05)，大果沙棘與雄性沙棘比較差異不顯著(P>0.05)，其他部位之間進(jìn)行比較均具有顯著性差異(P<0.05)；中枝所含黃酮含量大小依次為：雄性沙棘>大果沙棘>中果沙棘>小果沙棘，其中中果沙棘與大果沙棘比較差異不顯著(P>0.05)，大果沙棘與雄性沙棘比較差異不顯著(P>0.05)，其他部位之間進(jìn)行比較均具有顯著性差異(P<0.05)。大桿所含黃酮含量大小依次為：雄性沙棘>大果沙棘>中果沙棘>小果沙棘，不同部位之間進(jìn)行比較均具有顯著性差異(P<0.05)；枝葉混合所含黃酮含量大小依次為：大果沙棘>雄性沙棘>中果沙棘>小果沙棘，不同部位之間進(jìn)行比較結(jié)果顯示差異不顯著(P>0.05)。

表2 四種沙棘不同部位總黃酮含量的比較Table 2 Comparison of total flavonoids content in different parts of four Hippophae rhamnoides (mg/g)

注：S：樣品編號(hào)；1.小果沙棘；2.中果沙棘；3.大果沙棘；4.雄性沙棘；圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤; 同行肩標(biāo)相同小寫(xiě)字母者表示同一品種不同部位之間在0.05水平上差異不顯著；同列肩標(biāo)相同大寫(xiě)字母者表示不同品種同一部位之間在0.05水平上差異不顯著。

Note：S.sample number；1.Small fruit Hippophae rhamnoides；2.Middle fruit Hippophae rhamnoides；3.Big fruit Hippophae rhamnoides；4.Infertility Hippophae rhamnoides；Data in the table are mean±standard error;values with same lowercase superscripts mean no significant at level 0.05 at different parts of the same variety;Values with same capital letter superscripts indicate insignificant difference at 0.05 level at the same parts of different varieties.

3 討 論

本試驗(yàn)用以蘆丁做標(biāo)準(zhǔn)品所測(cè)葉中總黃酮含量范圍為8～12 mg/g，所測(cè)數(shù)據(jù)與施榮福等[6]、鄭京[11]及李垚等[12]關(guān)于沙棘葉中所含總黃酮含量的報(bào)道相一致。表明紫外分光光度法法具有操作簡(jiǎn)單、成本低、分析快、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

本試驗(yàn)對(duì)同一品種不同部位黃酮含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)枝葉中的黃酮含量均高于其他部位，總體表現(xiàn)為：枝葉>葉>小枝>中枝>大桿，這與不同種類植物體內(nèi)總黃酮含量的分布狀況相似[13-15]，而雄性沙棘的總黃酮含量則是在葉部較高，表現(xiàn)為：葉>枝葉>小枝>中枝>大桿；對(duì)不同品種同一部位進(jìn)行黃酮含量的測(cè)定，結(jié)果表明雄性沙棘的葉、中枝、大桿含量較其他品種較高。相關(guān)研究表明，黃酮類物質(zhì)是植物經(jīng)過(guò)光合作用產(chǎn)生的一大類化合物[16]，起始于苯丙烷代謝途徑[17]。葉是植物主要的光合器官，由此推斷葉可能是產(chǎn)生黃酮類物質(zhì)的主要器官。以上結(jié)果，可能由葉進(jìn)行光合作用合成黃酮類化合物，其中一部分在葉中積累，另一部分由莖轉(zhuǎn)運(yùn)至果實(shí)、水平根莖、側(cè)根和主根。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)可知，沙棘不同部位均有一定的黃酮含量，尤其以枝葉及葉中含量較高。小果沙棘、中果沙棘、大果沙棘中總黃酮含量大小依次為：枝葉>葉>小枝>中枝>大桿，而雄性沙棘各部位總黃酮含量大小依次為：葉>枝葉>小枝>中枝>大桿。本試驗(yàn)對(duì)其含量測(cè)定做了初步的研究，有利于沙棘枝葉的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用，以便充分利用天然植物資源，使其變成可被利用的寶貴資源。

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