馬倩倩，宋玲玲，王紅梅，方永志 ，王立群，何洪彬

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 奶牛研究中心，山東 濟(jì)南 250100；3.濟(jì)南軍區(qū)軍犬訓(xùn)練大隊(duì)，山東 濟(jì)南 250100)

血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)是刺激巨核細(xì)胞生長(zhǎng)[1]及分化的內(nèi)源性細(xì)胞因子，對(duì)巨核細(xì)胞生成的各階段均有刺激作用[2]，包括前體細(xì)胞的增殖和多倍體巨核細(xì)胞的發(fā)育及成熟，從而升高血小板數(shù)目。另外，TPO可直接作用于多功能造血干細(xì)胞，提高其分化和自我復(fù)制的能力[3]；而當(dāng)與紅細(xì)胞生成素聯(lián)合作用時(shí)，可促進(jìn)幼紅細(xì)胞系前體細(xì)胞的分化和增殖[4]；還可以抑制造血干細(xì)胞和幼稚巨核細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，因此TPO具有類“細(xì)胞生存因子”的作用。

TPO主要表達(dá)在肝和腎中[5]，在正常情況下，肝細(xì)胞(可能包括腎臟)持續(xù)低水平分泌TPO以有效地維持血清中TPO的濃度，保證血小板止血功能[6]。血小板減少癥是臨床上治療中遇到的重要問題之一，血小板減少癥見于血小板減少性紫癜，脾功能亢進(jìn)，血小板減少伴橈骨缺失綜合癥[7]，再生障礙性貧血和惡性血液疾病和腫瘤等癥。當(dāng)腫瘤患者受到集中的化療[8]和放療后，骨髓將受到不同程度的抑制。骨髓抑制及其并發(fā)的貧血，粒細(xì)胞減少和血小板減少是造成患者死亡的主要因素，也是臨床上限制放化療計(jì)量，提高療效的主要障礙。TPO是目前發(fā)現(xiàn)的唯一全程性參與巨核細(xì)胞增殖和分化的最基本的生長(zhǎng)因子。因此為了治療不同病因所引起血小板減少癥，研究TPO具有很重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株﹑質(zhì)粒和菌種 人肝cDNA﹑pcDNA3.1(+)表達(dá)質(zhì)粒、293T細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)均為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心保存，pEASY-T3，大腸桿菌感受態(tài)DH5α﹑BL21(DE3)均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 工具酶和主要試劑 LA Taq酶﹑T4 DNA連接酶﹑限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ﹑dNTP﹑Marker DL10 000﹑質(zhì)粒DNA純化試劑盒﹑DNA膠回收試劑盒及均購自寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；低分子量蛋白Marker為Fermentas公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、Dulbecco`s modified medium(DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清、G418購自Invitrogen公司；細(xì)胞基因組提取試劑盒(BioFlux)；鼠抗人血小板生成素單克隆抗體購自Sino Biological Inc公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG、β-actin抗體均購自Sigma公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank(U59493.1)上公布的人TPO mRNA完整的CDS基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物P1、P2，上游引物為：5'-CCAAGCTTGCCACCATGGAGCTGACTGAATTGCTCCTCG-3';下游引物為：5'-CGGAATTCTTACCCTTCCTGAGACAGATTCTGG-3'。P1含有酶切位點(diǎn)Hind Ⅲ(AAGCTT)及Kozark(GCCACC)序列；P2含有EcoR I(GAATTC)酶切位點(diǎn)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

1.2.2 hTPO基因克隆 以人肝cDNA為模板通過PCR擴(kuò)增hTPO基因(50 μL體系)：TaKaRa LA Taq(5 U/μL)0.5 μL﹑10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+plus)5 μL﹑dNTP Mixture(2.5mM)8 μL﹑目的基因上下游引(20 μM)各2 μL﹑模板2 μL；滅菌ddH2O 30.5 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃ 3 min﹑變性94 ℃ 30 s﹑退火60 ℃ 30 s﹑延伸72 ℃ 2 min﹑循環(huán)30次﹑72 ℃延伸8 min。取PCR產(chǎn)物5 μL于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

回收上述PCR產(chǎn)物后，克隆到載體pEASY-T3，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，次日篩選藍(lán)白斑。挑取白色單克隆，用LB(+Amp)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR及單酶切鑒定。將鑒定正確的菌液送往上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAstar軟件進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3 hTPO真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 測(cè)序正確的pEASY-T3-hTPO質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)分別用HindⅢ和EcoR I雙酶切后回收目的片段，應(yīng)用T4 DNA Ligase連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a。次日挑取單克隆，用LB(+Amp)擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將經(jīng)酶切初步鑒定正確的質(zhì)粒送往上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，用DNAstar軟件分析測(cè)序結(jié)果。將測(cè)序正確的陽性質(zhì)粒命名為pcDNA3.1(+)-hTPO。

1.2.4 pcDNA3.1(+)-hTPO轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 將pcDNA3.1(+)-hTPO質(zhì)粒及pcDNA3.1(+)空載分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染說明書。經(jīng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，用鼠抗人TPO單抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)，以判斷重組質(zhì)粒是否能夠表達(dá)。

1.2.5 CHO細(xì)胞的G418濃度的確定 將正常培養(yǎng)的CHO細(xì)胞，稀釋到48孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后其中一列(6孔平行)加入正常DMEM(含10%胎牛血清)，另7列分別加入含有不同濃度的G418的DMEM(含10%胎牛血清)，G418濃度分別為100、200、300、400、500、600、700 μg/mL。每三天換一次與之前相同的培養(yǎng)液，選擇在第七天細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度，作為下一步克隆篩選的濃度。

1.2.6 pcDNA3.1(+)-hTPO轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系 將pcDNA3.1(+)-hTPO轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。具體步驟參照1.2.4。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，加入含有G418的選擇性培養(yǎng)液，每三天換液1次，直至長(zhǎng)出清晰且相對(duì)較大的克隆，顯微鏡下挑單克隆于24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，4 d后消化傳代，取部分細(xì)胞留做作PCR驗(yàn)證及Western blot驗(yàn)證，根據(jù)Western blot結(jié)果確定真陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 hTPO基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以人肝cDNA為模板，用PCR獲得hTPO的編碼序列，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得與預(yù)期結(jié)果一致的1 074 bp左右特異性片段 (圖1)。

圖1 hTPO基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M.DNA 標(biāo)記；1.hTPO基因的PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR product of hTPO geneM.DNA Marker DL 10 000;1. PCR product of hTPO gene

2.2 hTPO真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

將PCR擴(kuò)增的hTPO基因克隆到pEASY-T3載體上，測(cè)序正確后，經(jīng)過雙酶切和T4連接酶連接亞克隆到pcDNA3.1(+)載體上，用質(zhì)粒提取試劑盒提取pcDNA3.1(+)-hTPO重組表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)Hind Ⅲ和EcoR I雙酶切鑒定?？梢娫诩s1 074 bp(hTPO基因)和約5 400 bp處〔pETcDNA3.1(+)〕各出現(xiàn)一條特異性條帶與預(yù)期目的條帶大小基本一致(圖2)。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒測(cè)序后，經(jīng)BLAST比對(duì)正確。

2.3 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞及Western blot檢測(cè)

圖2重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)的雙酶切鑒定
M.10 000 bp 的DNA標(biāo)記；1,2. 21 074 bp的為hTPO，5 400左右大小的為pcDNA3.1(+)
Fig.2 Identification of recombinant ppcDNA3.1(+)-hT-PO plasmid digested by Hind Ⅲ/EcoR I
M.DNA Marker DL 10 000;1,2. Band 1 074 bp was hTPO gene,band 5 400 bp was pcDNA3.1(+)

將pcDNA3.1(+)-hTPO及pcDNA3.1空載分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，應(yīng)用鼠抗人TPO單抗Western blot檢測(cè)蛋白是否表達(dá)。結(jié)果(圖3)顯示該重組質(zhì)粒能夠在293T細(xì)胞中表達(dá)hTPO蛋白，且大小在50～90 kD之間符合預(yù)期。

2.4 CHO細(xì)胞G418濃度的確定

經(jīng)過試驗(yàn)確定CHO細(xì)胞的G418最低致死濃度為400 μg/mL。

圖3 pcDNA3.1(+)-hTPO轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞Western blot1.pcDNA3.1(+)表達(dá)的蛋白；2. pcDNA3.1(+)-hTPO表達(dá)的蛋白Fig.3 The Western blot result of pcDNA3.1(+)-hTPO expressed in 293T1.expressed pcDNA3.1(+) protein;2.expressed pcDNA3.1 (+)-hTPO protein

2.5 轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系

挑取的克隆提取基因組經(jīng)過PCR驗(yàn)證及測(cè)序確定陽性的克隆，用鼠抗人TPO單克隆抗體Western blot驗(yàn)證篩選出的CHO細(xì)胞株是否能夠表達(dá)hTPO蛋白。由圖4、圖5知，3株細(xì)胞均能表達(dá)hTPO蛋白，且表達(dá)蛋白大小與預(yù)期一致，在50～90 kD之間。通過內(nèi)參β-actin抗體檢測(cè)3株細(xì)胞系表達(dá)蛋白水平有所差異，其中1株和4株β-actin蛋白表達(dá)量相當(dāng)，但hTPO蛋白1株表達(dá)量大于4株。

圖4挑取克隆的PCR驗(yàn)證
M.10 000 marker；1.陽性對(duì)照；2.陰性對(duì)照；3.克隆 1；4.克隆 2；5.克隆 3
Fig.4 PCR identification of clones
M.10 000 marker; 1.positive control; 2.negtive control;3.clone 1; 4.clone 2; 5.clone 3

3 討 論

本研究構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-hTPO真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)過瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞的Western blot首先確認(rèn)了該重組質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)，且表達(dá)的蛋白是在50～90 kD之間的單一條帶。本研究所表達(dá)的蛋白的分子量與氨基酸推測(cè)的分子量不符，成熟的TPO分子是由332氨基酸組成，由氨基酸推測(cè)其蛋白分子量為35 kD。這是由于TPO蛋白的氨基端含有與受體結(jié)合的活性結(jié)構(gòu)域和含有6～7個(gè)潛在的N-交聯(lián)糖基化位點(diǎn)的碳端非活性結(jié)構(gòu)域組成，導(dǎo)致TPO高度糖基化[9]。因此無論從血清中分離獲得還是重組細(xì)胞培養(yǎng)上清分離獲得的TPO，分子量一般在20～100 kD之間，而不是根據(jù)氨基酸推測(cè)的35 kD，從而也可能導(dǎo)致了碳末端雖與任何已知的蛋白質(zhì)無同源性，缺失這種基因不會(huì)影響蛋白質(zhì)的體外活性，但會(huì)降低其生物利用度。

hTPO蛋白是高度糖基化的蛋白，若預(yù)獲得具有生物活性的hTPO蛋白，選擇表達(dá)體系尤為重要。本試驗(yàn)選擇了中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)，因?yàn)镃HO具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的糖基化蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然蛋白分子；其次，CHO細(xì)胞具有不死性，可傳代百代以上，既可貼壁生長(zhǎng)，又可懸浮培養(yǎng)，是目前生物工程上廣泛使用的細(xì)胞。正式應(yīng)用于人類疾病治療或疾病預(yù)防的基因工程產(chǎn)品中許多產(chǎn)品均由CHO細(xì)胞生產(chǎn)(如EPO等)。CHO細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞(fibroblast)，是一種非分泌型細(xì)胞，它本身很少分泌CHO內(nèi)源蛋白，因此對(duì)hTPO蛋白下階段分離純化工作十分有利。本研究將pcDNA3.1(+)-hTPO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，經(jīng)過G418篩選獲得了3株能夠表達(dá)hTPO蛋白且表達(dá)水平不同的CHO細(xì)胞系，此3株細(xì)胞系經(jīng)傳代培養(yǎng)，均能夠在含G418 400 μg/mL的DMEM中穩(wěn)定生長(zhǎng)，其中穩(wěn)定細(xì)胞系1和穩(wěn)定細(xì)胞系3貼壁生長(zhǎng)最好。因此為下階段hTPO蛋白的大量純化提供多個(gè)細(xì)胞系選擇。

臨床上治療血小板減少癥所采取的手段主要是血小板輸入法。血小板輸入法雖可暫時(shí)減少出血事故，但必須經(jīng)常性輸入，費(fèi)用龐大，而且還存在其他限制：首先，儲(chǔ)存的血小板的壽命短，其次，有通過血液傳染其它疾病的危險(xiǎn)，以及異體免疫等問題。一般多次輸血后，近70%的病人會(huì)對(duì)輸入的血小板產(chǎn)生抗體，使以后的輸血效率大大減小。TPO它不僅能比其它造血因子更有效地增加血小板水平，還具有促進(jìn)其它造血細(xì)胞系活力的能力[10]。因此在臨床上為了降低感染風(fēng)險(xiǎn)和治療費(fèi)用，減輕患者痛苦，研究hTPO基因工程藥物具有重要的臨床意義。

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