田 華， 張松峰， 蘆 琨， 母傳賢， 沈永杰

(商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校1生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，2臨床醫(yī)學(xué)系，河南商丘476100)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，其主要病理特點是滑膜細胞增生，襯里層增厚，多種炎癥細胞浸潤，血管翳形成，以及軟骨和骨組織破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，但其確切機制目前未明。近年研究發(fā)現(xiàn)細胞因子［1］網(wǎng)絡(luò)失衡和基質(zhì)金屬蛋白酶［2］在RA的發(fā)生、炎癥遷延、關(guān)節(jié)的破壞中占有重要的地位。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)有抗腫瘤血管生成作用［3］，并能抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖和抗炎作用早已得到證實，但是其機制還不甚清楚。本實驗在成功地建立膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型的基礎(chǔ)上，通過檢測大鼠血清中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)、白細胞介素 17(interleukin 17，IL-17)和白細胞介素23(interleukin 23，IL-23)水平以及足爪皮下組織中基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13，MMP-13)的表達，探討TMP治療 CIA大鼠的可能機制，為臨床使用TMP治療RA提供新的理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。

材料和方法

1 動物

Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，雌雄各半，重約(180±20)g，購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，許可證號為SCXK(鄂)2012-0007。

2 主要試劑

磷酸川芎嗪片，無錫市第七制藥廠生產(chǎn)，規(guī)格:50 mg×100片，批號為030201;地塞米松鹽酸注射液(5 g·L－1)購自河南確山龍淵藥業(yè)有限公司。弗氏完全佐劑和雞Ⅱ型膠原由上海本草生物醫(yī)學(xué)工程所提供;多聚賴氨酸，Sigma生產(chǎn);冰醋酸，廣州化學(xué)試劑二廠生產(chǎn)。VEGF、IL-17和IL-23試劑盒，南京建成生物工程研究所提供;MMP-13小鼠單克隆抗體免疫組化S-P試劑盒(北京中山公司)，兔抗大鼠MMP-13單克隆抗體、兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體、IP細胞裂解液和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品。

3 主要方法

3．1 實驗動物分組及用藥 實驗分組:實驗用大鼠50只，按統(tǒng)計學(xué)方法隨機分為正常對照組10只和CIA模型組40只。模型復(fù)制方法:將雞Ⅱ型膠原15 mg 溶于7．5 mL 預(yù)先配制好的0．1 mol·L－1醋酸中，雞Ⅱ型膠原濃度為2 g·L－1，共7．5 mL，于4 ℃過夜充分溶解。次日，與弗氏完全佐劑等體積于冰浴中混合并使之充分乳化，制成穩(wěn)定的乳化劑15 mL(每mL含1 mgⅡ型膠原，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。在大鼠的左后肢足跖皮下注射0．1 mL致炎，第7天在大鼠尾、背多點皮下注射0．1 mL該膠原乳劑作為激發(fā)注射。正常對照組在同一部位同樣方法注射0．1 mL生理鹽水。造模后發(fā)現(xiàn)36只大鼠左足紅腫明顯，體積增大，說明造模成功，成功率為90%。將造模成功的36只大鼠隨機分為模型對照組、地塞米松治療組及 TMP 100 mg·kg－1及 50 mg·kg－1治療組，每組 9只。TMP組大鼠于造模后第7～35天ig給予TMP 100 mg·kg－1和50 mg·kg－1，每天用藥1 次;地塞米松治療組ig給予2 mg·kg－1，每天用藥1次;正常對照組和模型對照組ig給予2 mL·kg－1生理鹽水，每天用藥1次。

3．2 CIA大鼠體重測定 在致炎前(第0天)及致炎后第7、14、21、28和35天分別測量各組大鼠體重。3．3 血清細胞因子測定 實驗第36天向CIA大鼠腹腔內(nèi)注射3%巴比妥鈉0．3～0．4 mL麻醉。剪開大鼠腹腔，10 mL注射器心臟取血，室溫靜置1 h，3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清。用ELISA測定法(按試劑盒說明書進行操作)測定CIA大鼠血清中VEGF、IL-17和IL-23的含量。

3．4 病理切片 于制模第36天取下大鼠足跖部位的組織，用10%中性緩沖甲醛及時固定，石蠟包埋，切片，HE染色。

3．5 MMP-13 蛋白表達

3．5．1 免疫組化染色檢測 (1)取大鼠左足跖部位的組織，依次進行10%中性緩沖甲醛固定、石蠟包埋、切片、貼片(載玻片預(yù)先用多聚賴氨酸浸泡，撈片后于60℃加熱60 min，以使切片緊密貼附)及常規(guī)脫蠟至水后置 0．1 moL·L－1PBS(pH 7．4)中浸泡 5 min。(2)將切片浸入0．01 moL·L－1(pH 6．0)檸檬酸鹽緩沖液中，于微波爐中加熱至100℃、持續(xù)5 min，反復(fù)2次。室溫自然冷卻后，用0．1 moL·L－1PBS洗滌5 min×2次。(3)滴加封閉液羊血清置室溫20 min，甩去多余的液體。(4)滴加1∶50羊抗MMP-13抗體，陰性對照以PBS代替Ⅰ抗，于4℃孵育過夜，以0．1 moL·L－1PBS洗滌5min×3次。滴加生物素標(biāo)記Ⅱ抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×2次。(5)滴加鏈霉抗生物素－過氧化物酶溶液、室溫孵育10 min，同前述。(6)滴加試劑streptavidin-biotin complex(SABC)，于37℃孵育30 min，用PBS沖洗5 min×3次。(7)二氨基聯(lián)苯胺顯色:使用DAB顯色試劑盒，取1 mL蒸餾水，加試劑盒中試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，自來水沖洗。(8)滴加蘇木素輕度復(fù)染后，依次進行脫水、透明、中性膠封片及顯微鏡觀察。

3．5．2 結(jié)果判斷 以胞漿中出現(xiàn)淡黃至褐黃色細顆粒狀著色者為陽性細胞。在光學(xué)顯微鏡下，每只動物隨機計數(shù)500個細胞，計算每組的陽性表達率，同時記錄染色強度，淡黃色為弱陽性(+)，棕黃色為中等陽性(++)，棕褐色為強陽性(+++)，不著色為陰性(－)。

3．5．3 Western bloting檢測 取0．1 g大鼠左足跖部位的組織加入1 mL裂解液勻漿，12 000×g離心5 min，取上清液測蛋白濃度。將上清液與6×loading buffer混合后，沸水浴加熱5 min，離心取上清。于4℃凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移1 h至硝酸纖維膜，用5%脫脂奶粉溶液4℃封閉過夜，加入兔抗大鼠MMP-13抗體(工作濃度1∶1 000)室溫孵育1．5 h，PBS/T 洗膜3 ×10 min，加入HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(工作濃度1∶5 000)室溫孵育膜1 h，PBS/T洗膜4×15 min。曝光底片，掃描保存為電腦文件，用Gel-Pro Analyzer 4．0軟件將條帶的灰度值數(shù)字化。以GAPDH作內(nèi)參照，目的條帶與其相比得到相對量。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 11．6統(tǒng)計軟件進行分析，進行單因素方差分析，方差齊時，各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時，各組間兩兩比較采用Tamhance’s T2檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TMP對CIA大鼠體重的影響

CIA組大鼠于造模后第7天表現(xiàn)為食欲下降、體重減輕、活動減少、精神倦怠、明顯消瘦，與正常組大鼠相比差異顯著(P＜0．01);TMP(100 mg· kg－1)和地塞米松給藥14 d后可有效抑制CIA大鼠體重的減輕，與CIA組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)，而CIA+TMP(50 mg· kg－1)組與模型對照組比較無明顯效果，見表1。

表1 TMP對CIA大鼠體重的影響Table 1．Effect of TMP on body weight of CIA rats(g．Mean±SD．n=9～10)

2 TMP對CIA大鼠血清VEGF、IL-17和IL-23含量的影響

CIA組血清VEGF、IL-17和IL-23的含量均較正常組大幅度上升，分別上升了50．00%、62．22%和82．41%(P ＜0．01);與 CIA 組比較 CIA+TMP(100 mg·kg－1)組血清 VEGF、IL-17和 IL-23的含量明顯降低，分別降低了 33．33%、27．40%和 33．33%(P ＜0．01);與CIA組比較，地塞米松組血清VEGF、IL-17和IL-23的含量亦明顯降低，分別降低了30．77%、30．14%和 37．25%(P ＜ 0．01);而 CIA+TMP(50 mg·kg－1)治療組與CIA組比較血清 VEGF、IL-17和IL-23的含量無明顯變化，見表2。

表2 TMP對各組大鼠血清VEGF、IL-17和IL-23含量的影響Table 2．Effect of TMPon the content of serum VEGF，IL-17 and IL-23 in CIA rats(μg/L．Mean±SD．n=9～10)

3 TMP對CIA大鼠足爪組織病理改變的影響

正常組大鼠足爪皮下組織細胞排列規(guī)則，無炎癥細胞浸潤及血管新生;CIA組大鼠足爪皮下組織細胞排列紊亂，有大量炎癥細胞浸潤，血管增生明顯;TMP(100 mg·kg－1)和地塞米松均能明顯改善CIA大鼠足爪病理改變，皮下組織細胞排列較規(guī)則，亦明顯抑制炎癥細胞浸潤及血管增生現(xiàn)象;CIA+TMP(50 mg· kg－1)組大鼠足部皮膚的病理狀況無明顯變化，見圖1。

Figure 1．Effect of TMP on the histopathological changes of the paw tissues in CIA rats(×400)．A:normal group;B:CIA group;C:CIA+dexamethasone group;D:CIA+TMP(50 mg· kg－1)group;E:CIA+TMP(100 mg·kg－1)group．圖1 TMP對CIA大鼠足爪組織病理改變的影響

4 TMP對 CIA大鼠足爪組織中MMP-13蛋白表達的影響

4．1 免疫組化 MMP-13蛋白表達的陽性部位主要在胞漿中，在高倍鏡下可見胞漿內(nèi)有棕黃色的小顆粒。在正常組胞漿內(nèi)幾乎未見陽性染色區(qū)域;而CIA組胞漿染色呈棕黃色，MMP-13蛋白表達呈強陽性;CIA+TMP(100 mg·kg－1)和地塞米松組胞漿內(nèi)略見棕黃色的小顆粒，與CIA組比較差異顯著(P＜0.05);CIA+TMP(50 mg·kg－1)組胞漿內(nèi) MMP-13陽性表達與CIA組相比無顯著差異，見圖2、表3。

Figure 2．Effect of TMP on MMP-13 protein expression in the paw tissues of CIA rats(SABC，×400)．A:normal group;B:CIA group;C:CIA+dexamethasone group;D:CIA+TMP(50 mg· kg－1)group;E:CIA+TMP(100 mg·kg－1)group．圖2 TMP對CIA大鼠足爪組織中MMP-13表達的影響

4．2 Western blotting CIA組大鼠足爪組織MMP-13蛋白表達量約為正常組的2倍;與CIA組比較，CIA+TMP(100 mg·kg－1)組 MMP－13表達降低了31．82%(P ＜ 0.01)，而 CIA+TMP(500 mg·kg－1)組MMP-13表達基本上無變化;經(jīng)地塞米松治療后，MMP-13 表達降低了30．01%(P ＜0．01)，見圖3。

表3 各組大鼠足爪組織中MMP-13蛋白陽性表達率Table 3．Positive rates of MMP-13 expression in the paw tissues of CIA rats detected by immunohistochemistry(%．Mean±SD．n=9～10)

Figure 3．Effect of TMP on MMP-13 expression in the paw tissues of CIA rats determined by Western blotting assay．A:normal group;B:CIA group;C:CIA+dexamethasone group;D:CIA+TMP(50 mg· kg－1)group;E:CIA+TMP(100 mg·kg－1)group．Mean±SD．n=9～10．#P ＜0．05 vs normal group;△△P ＜0．01 vs CIA group．圖3 TMP對CIA大鼠足爪組織MMP-13蛋白表達的影響

討 論

本實驗用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)CIA大鼠模型，模型對照組大鼠逐漸出現(xiàn)食欲下降、體重減輕、活動減少、精神倦怠、明顯消瘦等現(xiàn)象;TMP(50 mg·kg－1)治療組用藥后，CIA大鼠一般狀況與模型對照組比較無明顯減輕，而TMP(100 mg·kg－1)劑量能明顯提高CIA大鼠食欲，增加CIA大鼠活動量，抑制CIA大鼠消瘦，增加其體重，改善CIA大鼠的精神狀況，表明TMP(100 mg·kg－1)對CIA有一定的治療效果。在此基礎(chǔ)上我們進一步探討了TMP治療RA的可能機制。TMP是中藥川芎的有效成分之一，屬酰胺類生物堿，化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪，有抗腫瘤血管生成、抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖、抗血小板聚集和抗炎等作用，目前已廣泛應(yīng)用于臨床，是現(xiàn)代中西醫(yī)治療RA的常用藥，但其作用機制尚不十分明確。

RA主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、滑膜血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、功能喪失。關(guān)節(jié)局部炎癥細胞的浸潤及其分泌的炎癥因子、酶等在RA關(guān)節(jié)炎性破壞中發(fā)揮重要作用［4］。

成纖維樣滑膜細胞過度增殖以及滑膜血管新生是RA滑膜炎和關(guān)節(jié)破壞的最主要原因［5］。VEGF是促進血管形成最重要的細胞因子，不僅促進了RA滑膜血管翳形成，而且也是RA發(fā)病過程中的直接促炎因子。Nagashima等［6］發(fā)現(xiàn)，VEGF在巨噬樣滑膜襯里細胞、血管平滑肌細胞和關(guān)節(jié)軟骨細胞中均有表達。IL-23是新近發(fā)現(xiàn)的一種異源二聚體細胞因子，近期研究發(fā)現(xiàn)RA患者滑膜組織中IL-23 p19 mRNA和蛋白表達明顯增高［7］。自然殺傷(natural killer，NK)細胞是機體重要的免疫細胞，參與一些自身免疫性疾病的發(fā)生，其表面有IL-23受體［8］。IL-23通過結(jié)合NK細胞膜表面IL-23受體復(fù)合物，通過胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(如JAK2、STAT3)誘導(dǎo)細胞激活［8］，活化的NK細胞可合成和分泌多種細胞因子，如TNF-α、TNF-β等，也可直接刺激 CD4+T細胞激活分泌IL-17等。IL-17是由促進關(guān)節(jié)炎癥的免疫細胞產(chǎn)生的一種強大的前炎癥細胞因子，也是炎癥反應(yīng)的微調(diào)因子，可以刺激成纖維細胞、角質(zhì)細胞、上皮及內(nèi)皮細胞釋放 IL-6、IL-8、前列腺素 E2(prostaglandin E2，PGE2)、基質(zhì)金屬蛋白酶、單核細胞化學(xué)趨化蛋白和粒細胞集落刺激因子等細胞因子。IL-17還可誘導(dǎo)人成纖維細胞表達細胞間黏附分子1，促進T細胞增殖。IL-17能夠與多種細胞因子產(chǎn)生協(xié)同作用，以放大炎癥反應(yīng)。在RA發(fā)病過程中，IL-17不僅可誘發(fā)人滑膜細胞產(chǎn)生GM-CSF和PGE2［9］，還可以通過PI3K途徑激活NF-κB，進而促進成纖維細胞釋放大量炎癥因子IL-6和IL-8［10］，誘導(dǎo)滑膜細胞分泌VEGF、肝細胞生長因子等多種促進血管生成的細胞因子。我們的研究證實，TMP(100 mg· kg－1)可明顯降低CIA大鼠血清中VEGF、IL-17和IL-23的含量。基質(zhì)金屬蛋白酶幾乎能降解所有細胞外基質(zhì)成分，還可激活其它基質(zhì)金屬蛋白酶，形成瀑布效應(yīng)。MMP-13是基質(zhì)金屬蛋白酶的一種，又名間質(zhì)膠原酶，可以降解細胞外基質(zhì)中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ及Ⅺ型膠原纖維，而這些成分也是關(guān)節(jié)軟骨的重要組成成分，在 RA 發(fā)病中起著重要作用［11］。同時，Kim 等［12］研究證實MMP-13在RA關(guān)節(jié)骨及軟骨的破壞中發(fā)揮重要作用。而我們的實驗同樣證明，TMP(100 mg·kg－1)可明顯下調(diào)CIA大鼠足爪皮下組織中MMP-13蛋白的表達，抑制CIA大鼠足爪皮下組織炎癥細胞浸潤劑血管增生。本研究中地塞米松與TMP(100 mg· kg－1)對CIA大鼠的治療效果都比較理想，但地塞米松為糖皮質(zhì)激素類藥物，長期使用易導(dǎo)致患者對激素的依賴性，食欲亢進，體重增加，面部及頸背部皮下脂肪增厚，胃及十二指腸潰瘍，胃腸出血，繼發(fā)感染、高血壓、糖尿病、肌肉無力、骨質(zhì)疏松等全身的不良反應(yīng)。而TMP藥物毒性低，避免了諸多藥物副作用。